第1个回答 2022-06-13
有些情况下，由于实验的需求，我们必须给重组质粒更换载体，为了使其标记颜色改变或者抗性改变或者其他，最简单的方法就是使用内切酶切下质粒中目标片段后，顺便用同样的内切酶切下新的载体，（这里要注意，新载体上有没有对应的酶切位点及其会不会切掉比较重要的组成部分）连接后使用。
目的：给 over expression的瞬时表达质粒（pflag-cMV），原载体为绿色荧光，换为红色荧光。
重组质粒：10ul；
5 μL 10x cut smart buffer
1 μL Cla1
1 μL kpn1
ddH2O补至50 μL
5 μg cheey载体
5 μL 10x cut smart buffer
1 μL Cla1
1 μL Kpn1
ddH2O补至50 μL
37度酶切过夜（菌落培养箱）
然后跑胶纯化，胶回收，
DNA需要使用纯化试剂盒直接纯化，质粒需要电泳跑胶纯化（胶中的质粒必须在曝光仪器上观看，紫外容易导致突变）
质粒酶切的时候会出现单链断裂等情况，所以我们需要跑胶，进行胶回收，纯化。质粒需要用50ul水溶解，DNA片段需要使用20ul的水溶解。
将退火产物与线性化质粒进行T4连接酶连接，连接过夜。
15ul 目标DNA片段（如果使用20ul，则14ul就可以）
2ul 线性化质粒（如果使用50ul，3ul质粒）
2μL 10x NEB T4 DNA ligase buffer
1μL NEB T4 DNA连接酶
（16度 连接过夜）
cheery
每个样品挑5个克隆 、ep管中加10uldd水 挑入克隆捶打混匀。取出八连管：
mix ：10ul
Flag-R：1ul ;
mCheery-F：1ul ;
克隆混合液：3ul ;
程序
pcr：95 3min
95 15s
56 15s
72 90s
72 10min
4 持续
2-4 30个循环
完成后看切的条带大小，一般跑胶，在皮曝光机器下看，与自己目的蛋白一样大小的kb带出现则提示连接成功。注意marker的选择。
然后将剩余7ul的克隆混合液加入amp的lb培养基800ul的样子 在摇床中摇 。
跑完胶后发现正确的条带后，将摇床上正确条带的菌群，转移到15ml的摇菌管，摇菌过夜。
？？