第1个回答 2016-07-09
1．种子消毒
成熟的水稻(Rice)种子去壳后放入无菌三角瓶中，用75%酒精浸泡1-2 min，无菌水冲洗2次；再用30% NaClO消毒30 min，其间需经常摇动，再用无菌水洗3-4次，用无菌滤纸吸干多余的水分，将种子接种到愈伤组织诱导培养基（MS + 2,4-D 2.0 mg/L）上，每皿约30粒，于28℃暗培养。
2．继代培养
经过近1月的诱导，水稻(Rice)长出黄色膨大的愈伤组织，去其盾片，将愈伤转至新鲜的愈伤组织诱导培养基（MS + 2,4-D 2.0 mg/L）上进行继代。每2周继代一次，一般继代2-4次即可获得适合转基因的嫩黄色、颗粒状的胚性愈伤组织。在继代培养2周后，挑选胚性颗粒用于遗传转化。
3．农杆菌的培养
在转化平板上挑取单菌落在1ml农杆菌培养基中培养。在50ml农杆菌培养基（含相应抗生素(antibiotic)）中加入1ml上述培养物，200rpm，28℃培养5-6hr至OD600为0.6-1.0，培养结束前2hr加入乙酰丁香酮（AS，终浓度100uM）。取上述菌液在室温下，4000rpm，10min，弃上清，加入MS液体培养基（含AS 100uM）重悬菌体，在与上相同的条件下培养2hr，使菌液的OD600=0.5左右，此时可用来转化愈伤组织。
4．共培养
将水稻(Rice)胚性愈伤组织浸入农杆菌菌液20-30min，再用无菌吸水纸吸干水分，将侵染的愈伤组织置于共培养培养基（MS + 2,4-D 2.0 mg/L + AS 100 uM）上，28℃暗培养三天。
5．洗菌
共培养的愈伤组织先用无菌水冲洗3遍，再浸泡在含Cef 250 mg/L的MS液体培养基中20-30min后，将愈伤组织转入无菌滤纸上吸干。
6．选择培养
将吸干水分的愈伤组织接种于选择培养基（MS + 2,4-D 2.0 mg/L + Hyg 30 mg/L + Cef 250 mg/L）上。3周后，挑选新长出的愈伤接种于选择培养基（MS + 2,4-D 2.0 mg/L + Hyg 50 mg/L + Cef 250 mg/L）上，再选择3周。
5．分化培养
将经过2次选择得到的抗性愈伤组织转入到预分化培养基（MS + KT 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L + 6-BA 2.0 mg/L + Hyg 30 mg/L + phytagel 5 g/L + 麦芽糖30g/L）上暗培养10天左右，再转到分化培养基（MS + KT 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L + 6-BA 2.0 mg/L + Hyg 30 mg/L + phytagel 2.5 g/L + 麦芽糖30 g/L）上光照培养。
7．生根培养
约1-2个月，将2cm左右高的幼苗转到生根培养基（1/2MS + NAA 0.5 mg/L + Hyg 15 mg/L + phytagel 2.5 g/L + 蔗糖20g/L）上诱导不定根的发生。
8．转基因苗的移栽
当幼苗长至10cm高时，将幼苗取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。本回答被提问者采纳