理解为产生phasiRNA的PHAS位点与编码蛋白的基因区有重叠可能更准确。
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小RNA是一类普遍存在的，多功能的抑制物，包括（1）microRNA（miRNA），由mRNA形成的茎环结构加工而成; （2）小干扰RNA（siRNA），在植物中通常由需要依赖RNA的 RNA聚合酶的过程衍生。我们构建并分析了大豆小RNA的表达图谱，鉴定了超过500个产生21个核苷酸的phased siRNAs（phasiRNA;来自PHAS位点）的位点，其中483个与注释的蛋白质编码基因有重叠。 通过整合miRNA与RNA end（PARE）数据的分析，检测到127个PHAS位点上的20个miRNA靶标 。 PHAS位点的主要类别（208，占41％）与NB-LRR基因相对应；这些小RNA中的一部分优先在根瘤中积累。在PHAS位点中，还观察到TAS3的新代表和非经典相位模式。由miR4392触发的非编码PHAS位点优先在花药中积累；预测phasiRNA靶向转座因子，在大豆生殖发育中具有峰值丰度。因此，phasiRNA在双子叶植物中显示出巨大的多样性。我们鉴定了新的miRNA并评估了miRBase中记录的大豆miRNA的准确性，显着改善了大豆miRNA注释，促进了miRBase注释的改进并鉴定了高严谨性的新miRNA及其靶标。
文章做了些什么：
小非编码RNA在发育，细胞分化，适应生物和非生物胁迫以及基因组稳定性方面具有重要作用。 小RNA的主要活性是通过靶标降解，翻译抑制或通过指导染色质修饰来对特定mRNA或基因表达模式进行负调控。迄今已鉴定出几种不同类型的小RNA。在植物中，研究最多的小RNA是microRNA（miRNA）和小干扰RNA（siRNA）;这些是由不同的前体和不同的途径产生的。 通常长度为21至22个核苷酸的miRNA 衍生自通过RNA聚合酶II从MIRNA基因转录的长非编码RNA前体。miRNA前体形成由DICER-LIKE1（DCL1）或其他DCL酶（极少数）加工的茎环结构，产生3’具有两个核苷酸突出的单个小RNA双链体（miRNA / miRNA *）。小RNA双链体的一条链是成熟miRNA，被称为引导链，它会结合到Argonaute（AGO）蛋白上以形成效应复合物（所谓的用于RNA诱导的沉默复合物——RISC），其指导miRNA靶标降解或翻译抑制。双链体的另一条链，即miRNA *或passenger strand，迅速降解，通常不会积累。 siRNA通常来自完全互补的长双链RNA（dsRNA）前体，这些前体一般由RNA依赖性的RNA聚合酶（RDR）形成，也可能由退火了的正义/反义转录物形成。已经在植物中定义了几类siRNA，主要类别是异染色质siRNA，它在胞嘧啶甲基化和抑制性组蛋白修饰的建立和维持中起关键作用。 siRNA还能够作为移动信号起作用，通过siRNA的运动使沉默效应从细胞扩散到其它细胞或更长距离。
科学家已经鉴定了一类相当有趣的siRNA，它们是长双链RNA前体以21个核苷酸为增量来逐步裂解的产物，产生定相的或完全间隔排列的小RNA。这些siRNA，即所谓的相位排列siRNA（phasiRNA），由特定的引导miRNA切割而产生，遵循单击或双击模式，分别对应一个22nt或两个21nt的miRNA的靶位点。切割的未加帽的mRNA产物用作RDR6的底物，产生dsRNA前体，然后被DCL4切割以产生21-核苷酸的定相siRNA。 一些定相siRNA已经显示在靶基因的反式调节中起作用;因此，这类siRNA最初被称为tasiRNA，但是更多的基因位点产生具有未知反式作用的相同相位模式（PHAS基因座）的siRNA，因此一般用“phasiRNA”进行描述。 tasiRNA通过对互补靶位点进行切割来调节mRNA，这如同许多植物miRNA一样。 最着名的tasiRNA是由TRANS-ACTING SIRNA GENE3（TAS3）产生的反式小干扰RNA-生长素响应因子（tasiARF）的集合。tasiARF在抑制生长素响应因子基因（ARF2，ARF3 / ETTIN和ARF4）中起作用 。已经在许多植物物种中鉴定出许多phasiRNA，包括拟南芥，水稻（Oryza sativa）和葡萄（Vitis vinifera）。已知PHAS基因座的数量在物种之间差异很大，从野生稻（Oryza rufipogon）中的800多个到拟南芥中的不到30个。在豆科植物中，分别在Medicago truncatula和大豆（Glycine max）中鉴定出114和41个PHAS基因座。
大豆在经济上是世界上最重要的豆类，它是蛋白质和食用油的主要来源之一。大豆的基因组序列现在可公开获得。基因组序列与下一代测序技术产生的数据一起，使得能够在全基因组范围内鉴定和定量小RNA。迄今为止，已在大豆中鉴定出数百种miRNA。然而，许多新注释的miRNA及其靶标尚未得到很好的验证，甚至注释的miRNA也经常在更强大的实验数据后进行校正。PHAS基因座比miRNA的注释更差。与Medicago truncatula相比，在大豆中鉴定出的PHAS位点要少得多。凭借广泛的小RNA数据和更高的测序深度，可以发现更多的PHAS。在这项研究中，我们分析了从不同组织中创建的大量小RNA文库，以构建小RNA的表达图谱并全面鉴定大豆中的PHAS基因座。 我们证明大豆中的许多蛋白质编码基因是PHAS基因座。 除了先前被鉴定为豆科植物PHAS基因座的NB-LRR之外，我们发现了数百种其他产生phasiRNA的蛋白质编码基因。 我们整合了RNA末端（PARE）数据的并行分析，以确定这些PHAS基因座的miRNA触发因子。 从这些数据中，我们验证了在miRBase（版本20）中记录的大豆miRNA并且鉴定了新的miRNA，证明了许多先前报道的miRNA具有siRNA的特征。基于表达分析，我们证明了phasiRNA以及已知和新发现的miRNA在不同组织和不同处理下的特异性表达。
总结
重点是流程图和过滤条件
探究了不同组织（或组织组合）中的miRNA富集差异。
图1.新的和组织优先miRNA的表达谱。
（A）在该研究中鉴定的新miRNA包括许多在特定组织或器官中差异富集的miRNA。
（B）对先前描述的大豆miRNA的分析还揭示了花，叶和根瘤中一系列的组织bias。
图2.编码蛋白质的PHAS基因。
比起其他研究过的植物基因组，大豆基因组含有更多的编码蛋白质的产生phasiRNA的基因座。
（A）编码PHAS基因座的类别和数量。
（B）NB-LRR家族中PHAS基因的表达谱和层次聚类。
（C）大豆基因组中phasi-NB-LRR基因的分布和聚类。
图3.大豆TAS3 TasiRNA的触发物和加工机制。
（A）来自大豆基因组中存在的六个TAS3基因座中的tasiRNA的总和在花，叶，根瘤和种子组织中的富集模式。 TAS3a和TAS3b是相同的，因此不能单独测量。
（B）源自TAS3a / b / c / d / e / f的TasiARF。所有TAS3 598D（+）和597D（+）siRNA的验证目标均在生长素响应因子（ARF）家族中，与其相对良好的保守序列一致（数据未显示）。
（C）在大豆TAS3基因座处存在两个或三个miR390靶位点，并且相对于这些靶位点的定相方向表明在TAS3e和TAS3f处由21个核苷酸的miRNA触发的siRNA的非典型加工方向。
图4.由TasiARF触发的ARF3 PHAS-Locus。
（A）大豆TAS3衍生的tasiARF在两个相同的位点靶向ARF3，通过PARE验证切割的59位点（下图）和未观察到切割的39位点。这种双击的tasiARF活性产生了定相siRNA（中图）。 y轴是phasing “score”，其是定相显著性的估计P值（ 参见方法 ）。 较低的两个图像是我们的Web浏览器，显示小RNA（中间）或PARE数据（下部），橙色虚线表示tasiARF切割位点。有色斑点是在y轴上显示丰度的小RNA ；浅蓝色斑点表示21个核苷酸的sRNA，绿色表示22个核苷酸的sRNA，橙色表示24个核苷酸的sRNA，其他颜色对应其他sRNA大小。红色框是带注释的外显子（粉红色是非翻译区域）。紫色线表示重复区的k-mer频数。
（B）来自图A的数据表明two-hit的phasiRNA生物发生的级联反应，其中21个核苷酸（nt）miR390触发21个核苷酸的tasiARF生物发生，并且通过two-hit机制，tasiARF触发来自ARF3和ARF4的额外二级siRNA的生成（参见补充图7在线）。 ARF siRNA可以顺式或反式起作用。
图5.源自Arogenate脱氢酶基因座的花药中高度富集的PhasiRNA。
（A）涉及雄激素脱氢酶的生化途径。
（B）来自雄激素脱氢酶相关基因座的phasiRNA产生的示意过程。在左侧，将形成发夹的基因片段加工成phasiRNA。
（C）来自不同组织中的两种arogenate dehydrogenase PHAS基因的miRNA触发物和phasiRNA的reads丰度水平（红色条）和基因表达水平（绿色条），其被标准化为RP5M和RP25M。
如何确定有没有匹配到tRNA，rRNA，snRNA和snoRNA？
降解组测序： http://www.ebiotrade.com/custom/LC_BIO/100427/index.htm