重组的DNA分子是在T4DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲液系统中，将上述二种酶切后的DNA分子进行连接。
(一)DNA连接酶的作用步骤
1.T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物(腺苷酰酶)
2.酶-AMP复合物再结合到具有5´-磷酸基和3´-羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化。
3.产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来。
(二)DNA的连接方式
在T4DNA连接酶的作用下的DNA连接反应，一般是随机的，但也可以通过对载体、目的基因的处理以控制与调整DNA的有效连接。
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