第1个回答 2022-06-28
单细胞测序技术已广泛应用于肿瘤方向的研究，但是受限于肿瘤细胞没有明确的Marker 基因，很难通过转录组数据从肿瘤细胞中区分正常和恶性肿瘤细胞。单细胞拷贝数变异（CNV）分析基于单细胞转录组数据，利用不同样本或不同细胞类型之间的基因表达量预测大规模染色体水平的CNVs，发现拷贝数异常的细胞，从而帮助推断肿瘤恶性细胞，为肿瘤异质性、克隆进化的研究奠定基础。
一、单细胞CNV分析方法
1.inferCNV
inferCNV[1]是由Broad机构开发的比较权威的单细胞CNV分析工具，其分析思路为：在整个基因组范围内，将每个肿瘤细胞基因表达与平均表达或“正常”参考细胞基因表达对比，通过热图的形式展示每条染色体上的基因相对表达量。可以直观看出，相对于正常细胞来讲，肿瘤细胞基因组会发生大规模的过表达或者低表达。
二、单细胞CNV分析应用思路
单细胞CNV预测分析可以推断肿瘤细胞，解析肿瘤细胞异质性，为探索肿瘤克隆进化、挖掘肿瘤发生机制提供参考。
1.区分肿瘤细胞与非恶性细胞
在肿瘤研究中，可以通过CNV预测分析区分肿瘤细胞和非恶性细胞。2018年纽约大学计算医学研究所等单位的研究人员在Nature Biotechnology发表了利用单细胞和空间转录组研究胰腺导管癌（PDAC）异质性的文章。为了区分癌细胞和非恶性导管细胞，该研究对PDAC-A和PDAC-B 2例单细胞数据进行了CNV预测分析。发现PDAC-A中高表达TM4SF1（簇1）和S100A4（簇2）的两个细胞群及PDAC-B中高表达TM4SF1的一个细胞群表现出拷贝数变异特征。通过免疫荧光验证发现PDAC-A中TM4SF1和S100A4在恶性导管细胞中表达，PDAC-B中TM4SF1与恶性细胞标志物KRT19共定位，结合CNV预测结果证实了PDAC样本存在转录不同的肿瘤细胞群。
2.探索肿瘤细胞异质性
在肿瘤研究中，可以通过CNV预测分析探索肿瘤细胞的异质性。2021年德克萨斯大学等单位的研究人员在Nature Medicine发表了利用单细胞转录组研究胃癌晚期腹腔转移病人腹水样本肿瘤细胞异质性的文章。该研究通过对腹水样本的肿瘤细胞进行CNV预测分析，并构建发育树，发现了5个具有不同CNV分布的亚群B1-B5。B5亚群显示结直肠样细胞特征，B2亚群由胃系细胞组成，B1、B3及B4亚群与B2和B5亚群共享部分CNV，揭示了胃癌肿瘤细胞的异质性。
3.揭示肿瘤的克隆进化
在肿瘤研究中，可以通过CNV预测分析探索肿瘤的克隆进化。2020年美国迈阿密大学等单位的研究人员在Nature Communications发表了利用单细胞测序研究葡萄膜黑色素瘤进化复杂性的文章。该研究对8例原发癌和3例转移癌进行单细胞CNV预测分析，发现不同样本间存在显著的拷贝数变异差异，揭示了葡萄膜黑色素瘤潜在的肿瘤间异质性。进一步根据某个CNV在细胞中的占比构建进化树，发现驱动葡萄膜黑色素瘤突变的3条进化轨迹—低度转移肿瘤中的EIF1AX突变、中度转移肿瘤中的SF3B1突变及高度转移肿瘤中的BAP1突变，绘制了葡萄膜黑色素瘤的进化轨迹及发展机制。
参考文献：
1. Anoop P. Patel, Itay Tirosh, et al. Single-cell RNA-seq Highlights Intratumoral Heterogeneity in Primary Glioblastoma[J]. Science, 2014, 344(6190):1396-401.
2. Moncada R, Barkley D, Wagner F, et al. Integrating Microarray-based Spatial Transcriptomics and Single-cell RNA-seq Reveals Tissue Architecture in Pancreatic Ductal Adenocarcinomas[J]. Nature Biotechnology, 2018, 38(3):333-342.
3. Wang R,Dang M, Harada K, et al. Single-cell Dissection of Intratumoral Heterogeneity and Lineage Diversity in Metastatic Gastric Adenocarcinoma[J]. Nature Medicine, 2021, 27(1):141-151.
4. Durante M A, Rodriguez D A, Kurtenbach S, et al. Single-cell Analysis Reveals New Evolutionary Complexity in Uveal Melanoma[J]. Nature Communications, 2020, 11(1):496.