微囊藻素的毒素检测

如题所述

第1个回答  2016-05-30

用于检测微囊藻毒素的方法有很多,例如生物分析法、细胞毒性检测法、酶联免疫吸附法(ELISA)、高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳法(CE)、蛋白磷酸酶抑制法等,这些方法都有各自的优点,但又有不同程度的缺陷性.生物检测法不能区分微囊藻毒素的异构体,工作量很大;细胞毒素检测法的灵敏度较低;高效液相色谱法的预处理过程繁琐,设备昂贵;CE法的重现性差;蛋白磷酸酶抑制法不能区分特异的毒素同系物,且后处理困难。 动物试验法是最早采用的常规毒性分析法,主要是采取对小鼠进行灌喂或腹腔注射来鉴定藻毒素的毒性。该方法能直观地反映微囊藻毒素的总体毒性。用纯化的MCs或蓝藻中粗提取的藻毒素进行测试,根据半致死剂量(LD50μg/kg)可初步确定其毒性。除个别异构体的LD50为200~250μg/kg,多数MCs的LD50为60~70μg/kg。该法具有操作简单,结果直观、快速等优点,但需要消耗较多的毒素,灵敏度和专一性都不高;无法准确定量,也不能辨别毒素的异构体类型;小鼠的维持费用高、工作量大。因此,动物试验法通常只作为毒性检测的最初筛选方法,并且正日益被其他方法所取代。
细胞毒性检测技术是利用毒素对细胞的毒性作用来检测毒素的一种技术,不仅可以判断毒素是否存在,还可以对毒素进行精确的定量。谷康定等用2步灌流法制备大鼠原代肝细胞,经MC-LR处理后,数小时后细胞形态学即发生改变,其灵敏度可达μg/L级。Fladmark等利用藻毒素诱导沙门氏菌和大鼠的原发性肝细胞死亡的能力为参数检测MC-LR,表明悬浮培养液中的沙门氏菌肝细胞为检测较广范围的肝毒素提供了迅速灵敏的系统。该技术灵敏度虽然较高,但操作繁琐,基本上处于初步研究阶段,较难得到推广应用。 高效液相色谱法(HPLC)是最常用的MC分析方法之一。自然界中MC常以痕量形式存在且干扰物质较多,所以色谱检测前必须先将样品通过萃取、吸附、富集等预处理,净化洗脱,再将洗脱液进行HPLC色谱分析,经检测器检测,将样品色谱图的保留时间和峰面积与标准品比较,从而进行定性和定量。HPLC检测MC主要使用的检测器有紫外(UV或VWD)、荧光(FL)、化学发光(CL)、二极管阵列(PDA 或DAD)等,最常用的是紫外和二极管阵列检测器。MC是一种环状多肽,其共轭双键在237 nm~239 nm下有最大吸收,故可通过紫外检测。紫外检测器成本较低,但MC各种异构体之间的特征吸收很接近,也就是说,紫外检测器在识别MC过程中存在相互干扰的缺陷,影响测定准确度;另外如果有其他物质伴随MC一同洗脱出来,其单波长吸收峰就会受到干扰。二极管阵列检测器比单波长紫外检测器分辨率高(它有一个特定的光谱吸收范围,通常是190 nm~280nm),噪音低,线性范围宽,其缺点是流动相的选择有一定限制,流动相的截止波长必须小于检测波长。
HPLC可以对MC进行定性和定量,是了解MC化学性质甚至结构的重要手段,但是它对高纯度标准品高度依赖,而由于技术的限制,商业用标准品又非常有限,这就限制了HPLC测定MC的发展。
液质联用法(LC-MS)以液相色谱为分离系统,质谱为检测系统。MC样品在质谱部分和流动相分离,被离子化后,经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开,经检测器得到质谱图。所以只要知道相对分子质量,就可以对样品进行精确的定量检测。1990年,LC/MS 技术首次被应用于蓝藻毒素的检测。
HPLC-电喷雾电离质谱法(HPLC-ESI-MS)是带有电喷雾离子化系统的质谱分析法。其大致原理是MC样品溶液在强电场的作用下破碎成许多细小的带有电荷的液滴,解吸出离子,离子碰撞活化裂解成碎片,从而获得分子的结构信息,样品的分子离子和裂片离子经一系列分离器和静电透镜进入质量分析器进行质谱分析。1993年开始使用此方法检测MC。
四极杆质谱由四根带有直流电压(DC)和叠加的射频电压(RF)的准确平行杆构成,相对的一对电极是等电位的,两对电极之间电位相反。当一组质荷比不同的离子进入由DC和RF组成的电场时,只有满足特定条件的离子稳定振荡通过四极杆,到达监测器而被检测。通过扫RF场可以获得质谱图。四极杆成本低,价格便宜,虽然日常分析的质荷比的范围只能达到3000,但由于分析器内部可容许较高压力,很适合在大气压条件下产生离子的ESI离子化方式,并且,ESI电离最突出特点是产生多电荷,MC电喷雾电离所产生的电荷分布在3000以下,所以四极杆广泛地与ESI联用,另外,三重四极杆由于可以做多级质谱,检出定量限(LOQ)为10pg,满足了低含量MC样品的检测要求。
离子肼质谱是利用离子肼作为分析器的质谱方法。离子肼(Ion trap)由一对环形电极和两个呈双曲面形的端盖电极组成。在环形电极上加射频电压或再加直流电压,上下两个端盖电极接地。逐渐增大射频电压的最高值,离子进入不稳定区,由端盖极上的小孔排出。因此,当射频电压的最高值逐渐增高时,质荷比从小到大的离子逐次排除并被记录而获得质谱图。离子肼质谱可以很方便的进行多级质谱分析,对于物质结构的鉴定非常有用。Zweigenbaum JA等人采用离子肼质谱对MC-LR、RR等进行质谱碎裂机理的研究,采用LC 柱富集技术,经切换阀将MC通入质谱,最后采用多级离子肼质谱对其母离子和碎片离子进行碎片断裂分析。
微囊藻素质谱图册参考资料。
飞行时间质谱根据相同能量的离子质量不同时速度不同的原理,使用电子电离源,施加脉冲拉出电压,再经加速极加快离子速度后进入无场区漂移管。不同质量的离子则以不同的时间通过相同的漂移距离到达接收器。飞行时间质谱扫描速度快,灵敏度高,此设备结构简单,不受质量范围限制。Pasquale Ferranti等首次运用高效液相/电喷雾-四极杆飞行时间串联质谱法(HPLC/ESI-Q-TOF-MS/MS)测定淡水中的MC-RR、-LR、-YR、-LW和-LF,其检出定量限(LOQ)均达到0.1μg/L。使用基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱法(MALDI-TOF-MS/MS)和离子肼串联质谱法(Ion trap-MS/MS)同时检测从而比较检测结果,结果证明HPLC/ESI-Q-TOF-MS/MS检测淡水中MC具有更高的灵敏度、选择性和重复性。
超高效液相色谱是分离科学中的一个全新类别,UPLC借助于HPLC的理论及原理,涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术,增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。与传统的HPLC相比,UPLC的速度、灵敏度及分离度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍。Jing Wang等运用超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)检测浙江省地表水中的MC-LR、-RR、-LW和-LF,回收率为91.7%~111%,RSD7.9% ~12%,检出定量限(LOQ)为2.5ng/L,6.0 ng/L,2.5ng/L和1.3ng/L。传统的液相色谱分离这四种MC需要30min,而UPLC只需要3min;Stuart A.Oehrle等运用UPLC-MS/MS检测淡水中的7种MC也只用了8 min,其HPLC检测需要35 min。 利用微囊藻毒素诱发免疫反应产生抗体,利用抗体对抗原的特异性识别来对各种毒素进行检测。以免疫技术为基础,微囊藻毒素的免疫化学法包括酶联免疫吸附法、放射免疫分析法、免疫亲和色谱法、胶体金法及免疫传感器法等。这类方法灵敏度较高、样品处理简单,便于操作,其检测限低于WHO水平,被认为是较有发展前景的方法。
自20世纪80年代末Kifir、Brooks等分别报道了对藻类毒素的单克隆抗体和多克隆抗体以后,酶联免疫吸附技术(ELISA)开始用于MCs的分析。该技术具有较高的灵敏度、快捷的分析速度等优点。直接竞争ELISA方法其原理是将抗藻毒素抗体包被在多孔板上,被检样品、MC-LR标准品与标记有过氧化物酶的MC-LR竞争性结合多孔板上的抗体,过氧化物酶催化底物产生的颜色与MC-LR的浓度成反比,即深色表明MC-LR浓度低,浅色表示MC-LR浓度高。也有将MC-LR牛血清白蛋白包被在多孔板上,利用第一抗体和带标记的抗体而建立的间接竞争ELISA方法。间接竞争ELISA比直接竞争ELISA方法灵敏度略高。
蛋白磷酸酶法可以反映各种毒素的总量,具有检测灵敏度高、测定时间较短等优点。Serres等让未标记的被测毒素和经放射性标记的MC-YR一起与蛋白磷酸脂酶2A(PP2A)进行竞争结合,达到平衡后进行凝胶过滤,使与PP2A结合的毒素和未与PP2A结合的毒素分离,然后检测收集到的待测125I-MC-YR-PP2A的放射性。根据用B/(Bo-B)(Bo为无毒素时125I-MC-YR的放射性,B为有标准毒素或待测毒素时125I-MC-YR的放射性)和标准毒素的浓度得到的标准曲线即可求出待测毒素的量。Wong等探索了利用比色法筛选水体中的MCs,试验中以P-硝基苯酚为底物,监测黄色产物P-硝基酚的生成速率以表示蛋白磷酸酶2A的活性。结果表明,比色法蛋白磷酸酶抑制分析是一种简便、便宜的筛选水体中具有肿瘤促进特性的MCs的工具。