微生物细胞含大量水分（一般在80%~90%以上） ，绝大多数必须染色，才能显微镜观察。
借助物理因素和化学因素的作用进行
细菌的 等电点较低，pH在2~5之间 ，故在中性、碱性、弱酸性溶液中，<u>菌体蛋白质</u>电离后带 负电荷 ；而碱性染料电离时<u>染料离子</u>带 正电 。
所以，细菌学上常用 碱性染料 染色。
染色操作程序：<u>制片→固定→媒染→染色→脱色→复染→水洗→干燥→镜检</u>
主要依据：
油浸物镜、观察完毕、<u>先用擦镜纸</u>擦去镜头上的油、在用擦镜纸蘸少许 乙醚乙醇混合液（乙醚2份、无水乙醇3份）or二甲苯 ，擦去残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭2~3下（朝一个方向）
普通光学显微镜<u>不能观察细胞和细菌的亚结构。</u>
设计原理： 丁达尔现象
光源的中央光束被阻挡、散射的光线投入物镜、整个视野是黑暗的。
暗视野中观察到的是 被检物体的衍射光图像 、并非物体本身、所以只能看到物体的 存在和运动 ，（ 不能 辨清物体的 细微结构 ）。用于→未染色标本的<u>活的</u>细菌、真菌，并可观察活细胞内的 线粒体及细菌鞭毛的运动 。观察 螺旋体 时多用暗视野显微镜。
暗视野聚光器→显微镜的聚光器支架上、显微镜灯照明， 聚光器和标本片之间要加一滴<u>香柏油</u> 。目的：避免聚光镜全反射。
将光线通过透明标本细节产生的 光程差（相位差）转化为光强差 的特种显微镜。
适用于对<u>活体细胞生活状态下的生长、运动、增殖情况及 细微结构 </u>的观察。
放上绿色滤光片
高发光效率的点光源→滤色系统→一定波长的光<u>（紫外光365nm、紫蓝光420nm）作为激发光</u>→激发标本内的荧光物质发射出荧光。
敏感性高、用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。
荧光光源一般采用 超高压汞灯（50~200W）、激发滤片（紫外、紫色、蓝色、绿色） 、阻断（或压制）滤光片
按光路区分
传统细菌：指人工培养基上易于增殖的细菌
“三段划线” 、目的：使细菌分散、生长为 单个菌落 、便于挑选目标细菌
类型：
烛缸、严格的分离操作-处理标本开始无氧的手套箱
使用特殊的培养基：添加胆固醇、马血清、酵母提取物、抗生素等。液体-添加酚红指示剂
固体培养基、5%CO2、37℃、 7日后用60倍低倍镜 斜投射光 观察是否生长、一般 3周左右 长成菌落。菌落中心 陷入平皿生长、“油煎蛋”样
支原体菌落坚实、无法挑取、灭菌 刀片切取菌落琼脂块 →移入液体培养基→棕红色变为黄绿色提示生长、支原体小→液体培养不会明显浑浊
反复2~3次。
L型→细胞壁缺损的细菌
在普通渗透压下、细胞壁缺损的细菌会“涨破”死亡→分离L型的培养基必须 高渗透压 。
<u>琼脂浓度0.5%（ 0.3 0.5%半固体、1.5% 2.5%固体 ）以下的半固体培养基，加马血清及10%蔗糖维持渗透压</u>（3%~5%NaCL？）L型可生长成 “油煎蛋”样细小菌落 。
专性细胞内寄生菌、必须动物及细胞分离
姬姆尼茨、吉姆萨染色
常用动物：小鼠、大鼠、豚鼠
注射：皮下、腹腔、静脉or特殊器官（如颅内接种）
已分离的病原菌在保存过程中突变→丧失致病能力→制成悬液<u>接种于动物→重新从动物分离出来→成为完整毒力的培养物</u>，过去是保存病原菌的常规做法→ 菌株的“复壮” （实际上是利用动物的疾病过程，将残留的具有毒力的致病细菌从大量无毒力的突变细菌中重新 分离出来 ）
最常用-革兰染色、特殊反应-荚膜肿胀试验等
霍乱弧菌鉴定：噬菌体-生物学分型
单克隆抗体检测特异性抗原：凝集试验、ELISA、免疫荧光试验、胶体金免疫吸附试验等
最常用实验同四
比抗原检测敏感性更高
通常使用 动物试验 。半数致死量为指标。
每 一次分离过程 、获得的纯培养物→称作 一“株” 该种细菌
所保存的培养物→称为该种细菌的“菌种”。
将细菌增殖到所需数量→这一过程称为“培养”。