怎么把一段2000bp且含有bamhi 和ecori酶切位点的dna片段克隆到一个质粒中及鉴

Question

如题所述

Answer 1

怎么把一段2000bp且含有BamHI 和EcoRI酶切位点的DNA片段克隆到一个质粒中及鉴定？如下：

1、选择载体类型：选择一个常用的克隆载体，例如pUC19、pGEM-T Easy或pBR322。这些载体都具有高拷贝数、易于在细菌中扩增以及带有方便的筛选标记（如抗性基因）等特点。具体选择哪种载体要根据实验需求和实验室条件来定。

2、酶切位点选择：由于您的DNA片段中含有BamHI和EcoRI的酶切位点，因此可以选用这两种限制性内切酶进行双酶切。这样可以在DNA片段两端产生不同的黏性末端，便于与载体的相应黏性末端连接。同时也要注意避免所选用的酶切位点出现在目的基因内部，以免破坏基因的完整性。

3、克隆过程：首先使用BamHI和EcoRI对含有目标DNA片段的PCR产物进行双酶切处理；同时对选择的质粒也进行相同的双酶切处理。然后使用凝胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中分别纯化回收线性化的目标DNA片段和线性质粒DNA。

接着利用T4 DNA连接酶将纯化后的线性DNA片段与线性质粒连接起来，形成一个重组质粒。最后将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中并涂布于含有适当抗生素的选择平板上进行培养。通过菌落PCR等方法筛选出阳性克隆并进行测序验证其正确性。

4、鉴定方法：可以采用菌落PCR、酶切验证及测序等方法进行鉴定是否为正确的插入。对于菌落PCR可以使用位于插入片段两侧的引物进行检测；

而酶切验证则可以利用BamHI 和 EcoRI 对提取出来的质粒再次进行消化来确认是否成功插入了大小合适的目标片段；最后还可以通过测序来确定所插入序列的准确性及其方向是否正确。