如何测定土壤中特定细菌的数量？

Question

如何测定土壤中特定细菌的数量？举例说明其技术路线

Answer 1

显微镜直接计数法和稀释平板计数法是测定微生物数量的常用方
法。
直接计数法中常用的是显微镜直接计数法，这种方法是先将待
测样品制成悬液，然后取一定量的悬液放在显微镜下进行计数(图1-
3-1)。根据在显微镜下观察到的微生物数目来计算出单位体积内的微
生物总数。直接计数法所需设备简单，可迅速得到结果，而且在计数
的同时能观察到所研究微生物的形态特征，其缺点是难以计数微小的
细菌。这种方法一般适用于纯培养悬浮液中各种单细胞菌体的计数。
间接计数法最常用的是稀释平板计
数法，它是根据微生物的培养特征而设计
的计数方法。这种方法在样品中含菌数较
少的情形下，也可以完成计数。
应用稀释平板计数法计数时，需要
将待测样品配制成均匀的系列稀释液，尽
量使样品中的微生物细胞分散开。再取一
定稀释度、一定量的稀释液接种到平板
中，使其均匀分布于平板中的培养基内；
或是将一定量的稀释液，与溶化后冷却至
45℃左右的琼脂培养基混合，倾入无菌培
养皿中，摇匀、静置待凝。经过培养后，
就由单个微生物生长繁殖形成菌落，这样
的一个菌落就代表着一个微生物个体。统
计培养基中出现的菌落数，即可推算出检
测样品中的活菌数。

FOR EXAMPLE:]
土壤中好气性细菌的计数
土壤中生活的微生物种类和数量是极其丰富的，这些数量众多的
微生物对提高土壤肥力有重要作用。因此，测定土壤中的含菌量可以
作为判定土壤肥力的一个重要指标。
材料器具
土壤样品；牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(附录二)、无菌水；培养皿、
移液管、天平、锥形瓶、试管、酒精灯、恒温培养箱、摇床等。
活动程序
1.制备土壤稀释液
取土壤表层5～10 cm 处的土样。准确称取1 g 土样，放入盛有
99 mL 无菌水的锥形瓶(250 mL，放有小玻璃珠)中，用手或摇床振荡
20 min，即制成102 倍的稀释液。
用1 mL无菌移液管，吸取10 2倍稀释液0.5 mL，移入装有4.5 mL
无菌水的试管中，配制成103 倍稀释液。
用同样的方法可制成稀释倍数为104、105、106 的系列稀释菌液
(图1-3-2)。
图

移液时，要将移液管插入液面，吹吸3 次，每次吸上的液面要高
于前一次，让菌液混合均匀并减少稀释中的误差。每配一个稀释度要
换用一支移液管。
2.取样及倒平板
将无菌培养皿编号，依次为104、105、106，每一号码设置三个
重复。
用无菌移液管三支，分别吸取稀释倍数为104、105、106的土壤稀释
液各0.2 mL，注入到相应编号的培养皿中(每个稀释倍数各三个培养皿)。
将已灭菌牛肉膏蛋白胨琼脂培养基溶化，待冷却至45～50 ℃左
右，倾入到无菌培养皿中，每皿约15 mL，轻轻转动培养皿，使土壤
稀释液与培养基混合均匀。
3.培养
将上述接种好的平板培养基冷却后，倒置放入28～30 ℃的恒温
培养箱中培养24～36 h，直至长出菌落为止。
4. 观察记录
将实验中得到的菌落数填入表1-3-1。
结果分析
1.选取具有合适菌落数的稀释倍数并计数。
在计算结果时，从接种的3 个稀释度中选择一个合适稀释倍数，
统计出菌落数(图1-3-3)。选择的原则是：
过

(1) 细菌、放线菌、酵母菌以每个培养皿内有30～300 个菌落为
宜。霉菌以每个培养皿内有10～100 个菌落为宜。
(2) 同一稀释倍数各个重复的菌落数相差不太悬殊。
2.将统计出的菌落数按下列公式计算，得出每克样品菌数。
每克土壤样品菌数= 某稀释倍数的菌落平均数×稀释倍数

Answer 2

一、课题目标

研究培养基对微生物的选择作用，进行微生物数量的测定。

二、课题重点与难点

课题重点：对土样的选取和选择培养基的配制。

课题难点：对分解尿素的细菌的计数。

三、课题背景分析

教材从尿素在农业上的重要用途切入，介绍了土壤中能分解尿素的细菌，进而说明这种细菌的作用是能够合成分解尿素的酶。教学中，教师可以联系生产生活实际，使学生对尿素以及分解尿素的细菌形成一定的感性认识。教材还简要地介绍了尿素的发现过程以及尿素合成的历史，这些都是“科学、技术、社会”教育的丰富素材。最后，教材明确指出了本课题的目的，有助于学生准确把握课题的方向。

四、研究思路

（一）筛选菌株

微生物的选择培养，是指利用培养基的组成使适宜生长的特定微生物得到较快繁殖的技术，也称为微生物的“选择培养”。在本课题提供的选择培养基的配方中，尿素是培养基中的惟一氮源，因此，原则上只有能够利用尿素的微生物才能够生长。但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能够在选择培养基上生长的微生物不一定是所需要的微生物，还需要进一步的验证。

（二）统计菌落数目

统计菌落数目的理论依据是：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。为了保证结果准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落数在30～300的平板进行计数。

教材中用楷体字编排的实例是为了说明设置重复组的重要性。第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。这个实例启示学生，在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。

（三）设置对照

A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。实验方案有两种。一种方案是可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。另一种方案是将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。

五、实验案例

土壤中某样品细菌的分离与计数

实验的具体操作步骤如下。

1.土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3 cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。

2.制备培养基 准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基，因此共需要15个选择培养基，5个牛肉膏蛋白胨培养基。此外，还需要准备8个灭菌的试管和1个灭菌的移液管。

3.微生物的培养与观察 参考课本中图2-7的实验流程示意图，将10 g土样加入盛有90 mL无菌生理盐水的锥形瓶中（锥形瓶体积为250 mL），充分摇匀，吸取上清液1 mL，转移至盛有9 mL的生理盐水的无菌大试管中，依次等比稀释至107稀释度，并按照由107～103稀释度的顺序分别吸取0.1 mL进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。

将涂布好的培养皿放在30 ℃温度下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。

挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基的斜面中，观察能否产生如课本中图2-10的颜色反应。

4.细菌的计数 当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目本回答被网友采纳

Answer 3

显微镜法

Answer 4

直接显微镜下细胞计数？