DNA的复制是一个复杂的过程，需要DNA模板、合成原料——三磷酸核苷酸、酶和蛋白质等多种物质的参与。
解旋酶：DNA复制涉及的第一个问题就是DNA两条链要在复制叉位置解开。DNA双螺旋并不会自动解旋，细胞中有一类特殊的蛋白质可以促使DNA在复制叉处打开，这就是解旋酶。解旋酶可以和单链DNA以及ATP结合，利用ATP分解生成ADP时产生的能量沿DNA链向前运动促使DNA双链打开。
单链DNA结合蛋白：解旋酶沿复制叉方向向前推进产生了一段单链区，但是这种单链DNA极不稳定，很快就会重新配对形成双链DNA或被核酸酶降解。在细胞内有大量单链DNA结合蛋白（single strand DNA binding protein，SSB），能很快地和单链DNA结合，防止其重新配对或降解。SSB结合到单链DNA上之后，使DNA呈伸展状态，有利于复制的进行。当新DNA链合成到某一位置时，该处的SSB便会脱落，可以重复利用。
DNA拓扑异构酶：DNA在细胞内往往以超螺旋状态存在，DNA拓扑异构酶催化同一DNA分子不同超螺旋状态之间的转变。DNA拓扑异构酶有两类。DNA拓扑异构酶I的作用是暂时切断一条DNA链，形成酶—DNA共价中间物，使超螺旋DNA松弛，再将切断的单链DNA连接起来，不需要任何辅助因子，如大肠杆菌的ε蛋白；DNA拓扑异构酶Ⅱ能将负超螺旋引入DNA分子，该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA，同时需要ATP水解提供能量，如大肠杆菌中的DNA旋转酶。
引物酶：引物酶在复制起点处合成RNA引物，引发DNA的复制。它与RNA聚合酶的区别在于可以催化核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的聚合，而RNA聚合酶只能催化核糖核苷酸的聚合，其功能是启动DNA转录合成RNA，将遗传信息由DNA传递到RNA。
DNA聚合酶：DNA聚合酶最早是在大肠杆菌中发现的，以后陆续在其他原核生物中找到。它们的共同性质是：以dNTP为前体催化DNA合成；需要模板和引物的存在；不能起始合成新的DNA链；催化dNTP加到生长中的DNA链的3′—OH末端；催化DNA合成的方向是5′→3′。
DNA连接酶：DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。它是一种封闭DNA链上的缺口的酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5′?磷酸基团的末端与另一DNA链的3′—OH生成磷酸二酯键。只有两条紧邻的DNA链才能被DNA连接酶催化连接。