检测细胞凋亡AV-PI双染的具体步骤是怎样的？注意事项有哪些？

Question

如题所述

Answer 1

除了上述的操作步骤，还有一个必须注意的，就是对照。阴性对照，阳性对照，还有调节通道的，只加PI,只加AV，这些都要设计好，要不测出来的值不可信。
细胞接种后，每日计数细胞数，连续观察7-10日，在对数坐标纸上绘制细胞生长曲线，确定曲线基本呈水平的部分即为指数生长期（一般在2-6日）。 各种细胞是不同的，肿瘤细胞一般在传代12－24h后进入指数生长期，72h进入平台期。
对数生长期是指细胞在一定的环境下经过了短暂的适应期，进而快速生长的时期，此时期营养充足，细胞会以对数生长，假如原来只有一个细胞，进入对数期以后就会变为两个，两个再变为四个，四个变为八个...即以2的N次方的速度生长(N为细胞的分裂次数)，在对数期生长速率远远大于死亡速率，所以在对数期最显著地特征就是细胞的数目大量增加，但当细胞经过一定时间的生长会消耗掉营养物质，产生大量的次生代谢产物使得pH值下降，其生长环境变得恶劣，此时生长速度下降，生长速率和死亡速率平衡，细胞的总个数基本保持不变，细胞的对数生长期结束进入平台期。追问

对即将进入实验室养细胞的同学，您有没有什么建议或者值得分享的经验啊？谢谢

追答

首先看你的实验室条件了，之前我们养细胞很多东西都不是一次性的，所以灭菌很关键。但现在应该大多数耗材都是一次性的，这就可以提高效率了，同时也可以避免污染。
刚学养细胞，先拿些细胞做预实验，主要是注意消化传代，还有换液。有人说养细胞很容易，但有人说养细胞太麻烦了。其实在实验室里有人形容养细胞就像养孩子，主要是细心。
建议去图书馆找些细胞培养技术的书看看。

Answer 2

一、原理

磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin V 是一种分子量为35~36kD 的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS 高亲和力特异性结合。将Annexin V 进行荧光素（FITC、PE）或Biotin 标记，以标记了的Annexin V 作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

碘化丙啶（propidine iodide，PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin V 与PI 匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

二、方法

1、调整待检测细胞浓度为106个/ml，取200ul， 1000rpm×5min(4℃)。

2、预冷的PBS1ml 润洗两次2，1000rpm×5min(4℃)。

3、将细胞重悬于100ul binding buffer，加入2ulAnnexin-V-FITC(20ug/ml)，轻轻混匀，避光冰上放置15分钟。

4、转至流式检测管，加入400ulPBS，每个样品临上机前加入1ulPI（50ug/ml），2分钟后迅速检测。

5、同时以不加Annexin V-FITC 及PI 的一管作为阴性对照。

三、注意事项

1、整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。

2、操作时注意避光，反应完毕后尽快在一小时内检测

四、结果判定

以AnnexinV为横轴，PI为纵轴；

左上象限为机械性损伤细胞；

右上为晚期凋亡细胞或者坏死细胞；

左下为阴性正常细胞；

右下为早期凋亡细胞。追问

检测细胞凋亡是一定要用对数期细胞吗？怎么判断细胞处于何期？谢谢

追答

你可以看细胞的分裂是否遵循对数生长，也就是细胞死亡很少，并且不断一2的n次增殖，其实最主要是看你的培养基中是否有你培养细胞的次级代谢产物大量积累，对对数期是不会或很少有次产物的，并且对数期细胞很少调亡，很少或没有衰老细胞出现，没有畸形细胞出现。

判断对数期方法：
要知道细胞的对数生长期，测定细胞生长曲线即可：
法一：
在同一规格的培养瓶中，接种同等量的同一代细胞，经培养后每隔24小时取出几瓶细胞进行计数，以培养时间为横座标，不同时刻的细胞数的对数为底座标，标出各点并连成线，即为该细胞的生长曲线，可反应出细胞生长的动态。
法二：
用96孔/24孔细胞培养板，分7组，每组3孔，培养一周(7天)，期间逐日检测一组，计数，最后把7天中的细胞数值绘成图，即为细胞生长曲线。
标准的细胞生长曲线类似微生物生长曲线，近似“S”形，一般在传代后第一天细胞数有所减少，经过一段时间的潜伏期，再进入对数生长期，达到平台期和生长稳定，最后衰老

Answer 3

记得阴性对照，阳性对照，还有调节通道