DNA提取过程中的关键步骤及注意事项有哪些

Question

如题所述

Answer 1

DNA提取的完整步骤 ：
1． 取新鲜或冷冻样品的肌肉组织100ul-200ul或95%ALC保存的样品组织0.05g。 2． 将组织尽量剪碎，分别装入1.5ml 的离心管中。
3． 每管中加入450ul的裂解缓冲液(10mM Tris-HCl pH8.0; 100mM EDTA, pH8.0)
4． 每管加入10% SDS 50-100ul(70-80不定) (1-2%),再加入2.5-5ul（3ul）蛋白酶K (20mg/ml),
是其终浓度达100ug/ml. 混匀，55℃ 3h至过夜（期间将管子颠倒几次）。 5． 样品中加入150ul NaCl（盐析作用），室温8000rpm离心20min，去沉淀，然后在上清液
中加入等体积（500ul）预冷异丙醇（沉淀DNA），混匀，20℃处理30min，14000rpm离心10min，去上清液。沉淀加70%ALC洗涤离心去ALC，室温挥发ALC5-10min，加TE 500ul，加10ul RNAase (终浓度4mg/ul)，即2.5ul。37℃ 30min 或65℃ 15min。
6． 加等体积酸液（提取DNA中的蛋白质）缓慢来回颠倒离心管10min，13000-15000rpm离心
10min。用移液管（大口Tip头）小心取出上层相至另外干净的离心管中，不要触到两相之间的白色蛋白层（可视情况重复操作 次）。 7． 加入等体积酚：氯仿(催取酚)（1：1），轻摇,缓慢颠倒混匀10min 13000-15000rpm 离心
5-10分钟，取上层清液于干净离心管中。
8． 加入等体积氯仿（氯仿：异戊醇（阻止氯仿挥发）=24：1），轻摇，缓慢颠倒混匀
10min,13000-15000rpm离心5-10min。取上清液加入1/10体积2M NaCl和等体积-20℃保存的无水乙醇（或等体积异丙醇）（沉淀DNA），沉淀DNA 10min,13000rpm离心5min，去上清，加入100-150ul70%ALC,离心，小心倒掉ALC（当心DNA沉淀丢失），用70%ALC再洗一次，然后去ALC。45℃烘箱烘干15-30min，用双蒸水沿管壁沿四周冲洗（TE量视DNA沉淀量而定，在80-250ul之间），溶解12-24h,-20℃保存备用。

注意事项：
1、 裂解液要预热,以抑制DNase,加速蛋白变性,促进DNA溶解。
2、 酚一定要碱平衡。苯酚具有高度腐蚀性，飞溅到皮肤、粘膜和眼睛会造成损伤，因此应注意防护。氯仿易燃、易爆、易挥发，具有神经毒作用，操作时应注意防护。
3、 各操作步骤要轻柔,尽量减少DNA的人为降解。
4、 取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰。
5、 异丙醇,乙醇.NaAc,KAc等要预冷,以减少DNA的降解,促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。
6、 提取DNA过程中所用到的试剂和器材要通过高压烤干等办法进行无核酸酶化处理。
7、 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。

Answer 2

DNA的粗提取
①准备材料
将新鲜菜花和体积分数为95%的酒精溶液放入冰箱冷冻室,至少24
h。
②取材
称取30
g菜花,去梗取花,切碎。
③研磨
将碎菜花放入研钵中,倒入10
mL研磨液,充分研磨10
min
。
④过滤
在漏斗中垫上尼龙纱布,将菜花研磨液滤入烧杯中(有条件的学校可将滤液倒入塑料离心管中进行离心,用1
000r/min的旋转频率,离心25
min,取上清液放入烧杯中)。在4
℃冰箱中放置几分后,再取上清液。
⑤加冷酒精
将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体积分数为95%的冷酒精溶液中,并用玻璃棒缓缓地轻轻搅拌溶液(玻璃棒不要直插烧杯底部)。沉淀35
min后,可见白色的DNA絮状物出现。用玻璃棒缓缓旋转,絮状物会缠在玻璃棒上。
(2)DNA的鉴定
①配制二苯胺试剂
取0.1
mL
B液,滴入到10
mL
A液中,混匀。
②鉴定
取4
mL
DNA提取液放入试管中,加入4
mL
二苯胺试剂,混匀后观察溶液颜色(不变蓝)。用沸水浴(100
℃)加热10
min
。在加热过程中,随时注意试管中溶液颜色的变化(逐渐出现浅蓝色)。
研磨液的配制方法
Tris：10.1
g(相对分子质量为121.14),先加50
mL
蒸馏水溶解,用物质的量浓度为2
moL/L
的盐酸调至pH8.0,再加下述药品。
NaCl：8.76
g(相对分子质量58.44)
EDTA：37.2
g(相对分子质量372.24)
SDS：20
g(相对分子质量288.3)
待上述药品全部溶解后,再用蒸馏水定容至1
000
mL。
若在室温低于20
℃时配制药液,SDS呈沉淀析出,此时需要加温,才能将SDS溶解。如果提前配制的研磨液出现了沉淀,则应加温使沉淀溶解后再使用。
研磨液中几种药品的作用
SDS(十二烷基磺酸钠):可使蛋白质变性,与DNA分离。
EDTA(乙二胺四乙酸二钠):为DNA酶的抑制剂,可以防止细胞破碎后DNA酶降解DNA。
物质的量浓度为0.15
moL/L的氯化钠溶液：能很好地溶解DNA。
Tris/HCl：提供缓冲体系,DNA在这个缓冲体系中呈稳定状态。(Tris为三羟甲基氨基甲烷)
鉴定DNA的其他方法
用紫外灯照射法鉴定DNA效果很好。具体鉴定方法如下。
1.配制染色剂。用蒸馏水配制万分之五的溴化乙锭(EB)溶液。
2.将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹于蜡纸上,再滴1滴EB溶液染色。
3.将蜡纸放在紫外灯(260
nm)下照射(暗室中),可见橙红色的萤光(DNA的紫外吸收高峰在280
nm处)。
O(∩_∩)O~

Answer 3

一、DNA提取的完整步骤 ：

1． 取新鲜或冷冻样品的肌肉组织100ul-200ul或95%ALC保存的样品组织0.05g。 2． 将组织尽量剪碎，分别装入1.5ml 的离心管中。

3． 每管中加入450ul的裂解缓冲液(10mM Tris-HCl pH8.0; 100mM EDTA, pH8.0)

4． 每管加入10% SDS 50-100ul(70-80不定)  (1-2%),再加入2.5-5ul（3ul）蛋白酶K (20mg/ml)，使其终浓度达100ug/ml. 混匀，55℃ 3h至过夜（期间将管子颠倒几次）。

5． 样品中加入150ul NaCl（盐析作用），室温8000rpm离心20min，去沉淀，然后在上清液
中加入等体积（500ul）预冷异丙醇（沉淀DNA），混匀，20℃处理30min，14000rpm离心10min，去上清液。沉淀加70%ALC洗涤离心去ALC，室温挥发ALC5-10min，加TE 500ul，加10ul RNAase (终浓度4mg/ul)，即2.5ul。37℃ 30min 或65℃ 15min。

6． 加等体积酸液（提取DNA中的蛋白质）缓慢来回颠倒离心管10min，13000-15000rpm离心10min。用移液管（大口Tip头）小心取出上层相至另外干净的离心管中，不要触到两相之间的白色蛋白层（可视情况重复操作 次）。

7． 加入等体积酚：氯仿(催取酚)（1：1），轻摇,缓慢颠倒混匀10min 13000-15000rpm 离心5-10分钟，取上层清液于干净离心管中。

8． 加入等体积氯仿（氯仿：异戊醇（阻止氯仿挥发）=24：1），轻摇，缓慢颠倒混匀
10min,13000-15000rpm离心5-10min。取上清液加入1/10体积2M NaCl和等体积-20℃保存的无水乙醇（或等体积异丙醇）（沉淀DNA），沉淀DNA 10min,13000rpm离心5min，去上清，加入100-150ul70%ALC,离心，小心倒掉ALC（当心DNA沉淀丢失），用70%ALC再洗一次，然后去ALC。45℃烘箱烘干15-30min，用双蒸水沿管壁沿四周冲洗（TE量视DNA沉淀量而定，在80-250ul之间），溶解12-24h,-20℃保存备用。

二、注意事项：

1、 裂解液要预热,以抑制DNase,加速蛋白变性,促进DNA溶解。

2、 酚一定要碱平衡。苯酚具有高度腐蚀性，飞溅到皮肤、粘膜和眼睛会造成损伤，因此应注意防护。氯仿易燃、易爆、易挥发，具有神经毒作用，操作时应注意防护。

3、 各操作步骤要轻柔,尽量减少DNA的人为降解。

4、 取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰。

5、 异丙醇,乙醇.NaAc,KAc等要预冷,以减少DNA的降解,促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。

6、 提取DNA过程中所用到的试剂和器材要通过高压烤干等办法进行无核酸酶化处理。

7、 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。

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Answer 4

DNA提取的完整步骤 ：
1． 取新鲜或冷冻样品的肌肉组织100ul-200ul或95%ALC保存的样品组织0.05g。 2． 将组织尽量剪碎，分别装入1.5ml 的离心管中。
3． 每管中加入450ul的裂解缓冲液(10mM Tris-HCl pH8.0; 100mM EDTA, pH8.0)
4． 每管加入10% SDS 50-100ul(70-80不定) (1-2%),再加入2.5-5ul（3ul）蛋白酶K (20mg/ml),
是其终浓度达100ug/ml. 混匀，55℃ 3h至过夜（期间将管子颠倒几次）。 5． 样品中加入150ul NaCl（盐析作用），室温8000rpm离心20min，去沉淀，然后在上清液
中加入等体积（500ul）预冷异丙醇（沉淀DNA），混匀，20℃处理30min，14000rpm离心10min，去上清液。沉淀加70%ALC洗涤离心去ALC，室温挥发ALC5-10min，加TE 500ul，加10ul RNAase (终浓度4mg/ul)，即2.5ul。37℃ 30min 或65℃ 15min。
6． 加等体积酸液（提取DNA中的蛋白质）缓慢来回颠倒离心管10min，13000-15000rpm离心
10min。用移液管（大口Tip头）小心取出上层相至另外干净的离心管中，不要触到两相之间的白色蛋白层（可视情况重复操作 次）。 7． 加入等体积酚：氯仿(催取酚)（1：1），轻摇,缓慢颠倒混匀10min 13000-15000rpm 离心
5-10分钟，取上层清液于干净离心管中。
8． 加入等体积氯仿（氯仿：异戊醇（阻止氯仿挥发）=24：1），轻摇，缓慢颠倒混匀
10min,13000-15000rpm离心5-10min。取上清液加入1/10体积2M NaCl和等体积-20℃保存的无水乙醇（或等体积异丙醇）（沉淀DNA），沉淀DNA 10min,13000rpm离心5min，去上清，加入100-150ul70%ALC,离心，小心倒掉ALC（当心DNA沉淀丢失），用70%ALC再洗一次，然后去ALC。45℃烘箱烘干15-30min，用双蒸水沿管壁沿四周冲洗（TE量视DNA沉淀量而定，在80-250ul之间），溶解12-24h,-20℃保存备用。
注意事项：
1、 裂解液要预热,以抑制DNase,加速蛋白变性,促进DNA溶解。
2、 酚一定

Answer 5

这个太专业了，你最好问一下专业人士。