overlap PCR的P不出来，请教~

Question

我有180bp的碱基序列，中间在100bp-120bp的碱基，我想将它替换成其他碱基序列，所以我将前120bp为一个片段A，后面为一个片段B，我设计的引物A1(20bp)Tm58，A2（34bp）Tm61.88，A2前15bp是与模板碱基序列互补的，A2后面19bp是我想要替换的碱基。引物B1前19个是我要替换的碱基，后15个与模板碱基互补，B2（20bp），我想用OVERLAP PCR的方法，再将P出来的两端连起来，合成180bp的序列。.但是我在第一轮PCR就没有P出来我的目的条带，条带为250bp，我根据prime5的Ta值46度作为的退火温度，是不是退火温度不对呀，请教各位到底应该是怎么回事，问题出在哪里呀？

Answer 1

几点考虑：

你的A2和B1和原来模板的互补区太短了。或者说你加上的序列和互补区的比例太大了，影响PCR的反应

先试一下，看看你的A1和B2在一起P，能不能有结果