大球盖菇的菌种制作方法与常见的蘑菇和草菇类似，主要采用组织分离法或孢子分离法获得纯正菌种。新区通常通过引进母种或原种进行种植。以下是几种适合大球盖菇母种培育的培养基配方：
母种培养基
- 麦芽糖酵母琼脂培养基（MYA）：大豆蛋白胨1克、酵母2克、麦芽糖20克、琼脂20克，加水至1000毫升。
- 马铃薯葡萄糖酵母琼脂培养基（PDYA）：马铃薯300克（加水1500毫升，煮20分钟，滤汁）、酵母2克、豆胨1克、葡萄糖10克、琼脂20克，加水至1000毫升。
- 燕麦粉麦芽糖酵母琼脂培养基（DMYA）：燕麦粉80克、麦芽糖10克、酵母2克、琼脂20克，加水至1000毫升。若不加琼脂，这些可以作为液体培养基。
制作原种和栽培种的培养基则包括：
使用小麦秆或裸麦秆，切碎后泡湿，装瓶，高压灭菌备用。
谷物如小麦、高粱、玉米和小米浸泡煮透，加2%碳酸钙后装瓶，同样高压灭菌。
木屑和小木片40%，麸皮20%，混合制作栽培种培养基。
平菇或金针菇的下脚料同样需经过重新灭菌后备用。
接种时，可以使用培养3-4天的液体菌种，固体菌种则需适当增加接种量，至少10%，最好15%-20%。接种后，将菌种瓶或袋放在20-28℃的培养室中，菌丝生长初期速度较快，随着生长，可能减慢。为了促进生长，可以定期搅拌液体菌种接种的无菌麦粒培养基，每3-7天摇瓶一次，以利于菌丝再生和保持生长活力。