质粒DNA纯化的从质粒DNA制品中去除RNA

Question

如题所述

Answer 1

对于某些用途（例如用BAL31进生活化或用T4噬菌体多核苷酸激酥标记质粒DNA的限制切片段的5'端），必须获得无RNA污染的DNA制品。尽管在通过氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心所制备的质粒DNA中，这样的RNA污染物的质量已很少，但其中的RNA分子数仍可能相当可观，并可在限制酶消化反应的全部5'端中占据较大的比例。通过下述方法，可以从质粒制品中去除RNA。通过Bio-Gel A-150m或Sepharose CL-4B进行层析
1、 制备质粒DNA。
2、 有等体积的经TE(pH8.0)平衡后的酚抽提1次。
3、 将至多1ml的水相铺在经TE(pH8.0)和0.1%SDS平衡的Bio-Gel A-150m或Sepharase CL-4B(1x10cm)柱上。
4、 将DNA装入层柱并在柱的上部连接上含0.1%SDS的TE(pH8.0)的贮液瓶，立即开始以0.5ml流出液为1流进行收集。
5、 当收集到15份时，关闭柱底部，为明确质粒DNA的分布情况，可在每份收集物中取10μg样品，通过0.7%琼脂糖凝胶电泳或溴化乙锭荧光进行分析。
6、 将含质粒DNA的组成合并在一起，加2倍体积的乙醇于4℃沉淀10min，然后以4℃大于10 000rpm离心15min，以回收DNA。