多肽合成方法有哪些

Question

如题所述

Answer 1

多肽合成方法之酰基叠氮物法：
Theodor Curtius 在 1902 年首次将酰基叠氮物法应用于肽化学，这是最早的缩合方法之一。在碱性水溶液中，除了游离氨基酸和肽外，氨基酸酯可在有机溶剂中使用。与其他缩合方法不同，该方法不需要额外的碱或氨基组分来捕获腙酸。长期以来，叠氮物法被认为是唯一不发生消旋的缩合方法，随着选择性裂解的氨基酸保护基的引入，该方法经历了一次大规模复兴。该方法的起始原料是晶体状的氨基酸酰肼或肽酰肼，通过肼解相应的酯很容易得到。在 -10℃ 的盐酸中，用等当量的亚硝酸钠使酰肼发生亚硝化转化为叠氮化物，然后与相应的氨基组分反应。有些叠氮化物可用冰水稀释后沉淀出来。
二苯磷酰基叠氮化物（DPPA）也可用于酰基叠氮化物的合成。Honzl-Rudinger 方法采用亚硝酸叔丁作为亚硝化试剂，使叠氮缩合反应可在有机溶剂中进行。由于酰基叠氮化物的热不稳定性，缩合反应需在低温下进行。当温度较高时，Curtius 重排，即酰基叠氮转化为异氰酸酯的反应成为一个主要的副反应，最终导致生成副产物脲。由于反应温度低（如 4℃），肽缩合反应通常需要几天才能完全。
对于较长的 N 端保护的肽链，酯基的肼解一般比较困难，因此，使用正交的 N 保护肼衍生物是一种选择。在肼基的选择性脱除后，按倒接（backing-off）策略组合的肽片段可以用于叠氮缩合。虽然叠氮法一直被认为是消旋化倾向最小的缩合方法，但在反应中，过量的碱会诱发相当大的消旋。因此，在缩合反应期间要避免与碱接触，例如，氨基组分的铵盐应采用 N，N-二异丙胺或 N-烷基吗啉代替三乙胺来中和。
多肽合成方法之酸酐法：
Theodor Curtius 在 1881 年对苯甲酰基氨基乙酸的合成进行了早期研究，这是多肽合成中最初考虑应用酸酐的方法。从氨基乙酸银与苯甲酰氯的反应中，除了获得苯甲酰氨基乙酸外，还得到了 BZ-Glyn-OH（n=2-6）。早期曾认为，当用苯甲酰氯处理时，N-苯甲酰基氨基酸或 N-苯甲酰基肽与苯甲酸形成了活性中间体不对称酸酐。
大约 70 年后，Theodor Wieland 利用这些发现将混合酸酐法用于现代多肽合成。目前，除该方法外，对称酸酐以及由氨基酸的羧基和氨基甲酸在分子内形成的 N-羧基内酸酐（NCA, Leuchs anhydrides）也用于肽缩合。不对称酸酐常常参与生化反应中的酰化反应。混合酸酐法有机羧酸和无机酸皆可用于混合酸酐的形成。然而，仅有几个得到了广泛的实际应用，多数情况下，采用氯甲酸烷基酯。过去频繁使用的氯甲酸乙酯，目前主要被氯甲酸异丁酯所替代。
由羧基组分和氯甲酸酯起始形成的混合酸酐，其氨解反应的区域选择性依赖于两个互相竞争的羰基的亲电性和（或）空间位阻。在由 N 保护的氨基酸羧酸盐（羧基组分）和氯甲酸烷基酯（活化组分，例如源于氯甲酸烷基酯）形成混合酸酐时，亲核试剂胺主要进攻氨基酸组分的羧基，形成预期的肽衍生物，并且释放出游离酸形式的活性成分。当应用氯甲酸烷基酯（R1=异丁基、乙基等）时，游离的单烷基碳酸不稳定，立即分解为二氧化碳和相应的醇。然而，对于亲核进攻的区域选择性，也有一些相反的报道，产物为氨基甲酸酯和原来皮郑羡的 N 保护氨基酸组分。
为了形成混合酸酐，将 N 保护的氨基酸或肽分别溶于二氯甲烷、四氢呋喃、二氧六环、乙腈、乙酸乙酯或 DMF 中，用等当量的三级碱（N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、N-乙基吗啉等）处理。然后，在 -15℃－5℃，剧烈搅拌的同时加入氯甲酸烷基酯以形成不对称酸酐（活化）。经短时间活化后，加入亲核性氨基酸组分。如果作为铵盐使用（需要更多的碱），必须避免碱的过量使用。如果严格按照以上的反应条件，混合酸酐法很容易进行，是最有效的缩合方法之一。
对称酸酐法Nα－酰基氨基酸的对称酸酐是用于肽键形成的高活性中间体。与混合酸酐法相反，它与胺亲核试剂的反应没有模棱两可的区域选择性。肽缩合产率最高，为 50%（以羧基组分计）。虽然由对称酸酐氨解形成的游离 Nα－酰基氨基酸可以和目标肽一起，通过饱和碳酸氢钠溶液萃取回收，但在最初，这种方法的实用价值极低。对称酸酐可以用 Nα－保护氨基酸与光气，或方便的碳二亚胺反应制得。两当量的 Nα－保护氨基酸与－当量的碳二亚胺反应有利于对称酸酐的形成，对称酸酐可以分离出来，也可不经纯化而直接用于后面的缩合反应。基于 Nα－烷氧羰基氨基酸的对称酸酐对水解稳定，可采用类似上述纯化混合酸酐的方法进行纯化。
由于 Boc- 保护氨基酸的商品化和合理的价格，在肽链的逐步延长中，使用对称酸酐法日益受到重视。虽然可以买到晶状的对称酸酐，但原位制备仍然是一种不错的选择。碳二亚胺法碳二亚胺类化合物可用于氨基和羧基的缩合。在该类化合物中 N，Nˊ－二环己基碳二亚胺（DCC）相对便宜，而且可溶于肽合成常用的溶剂。在肽键形成期间，碳二亚胺转变为相应的脲衍生物，N，Nˊ－二环己基脲可以从反应液中沉淀出来。显然，碳二亚胺活化后的活性中间体氨解和水解速率不同，使肽合成能在含水介质进行。经几个课题组的大量研究，确立了以碳二亚胺为缩合剂的肽缩合反应机理，羧酸根离子加成到质子化的碳二亚胺，形成高活性的 O－酰基脲；虽然还没有分离出这个中间体，但通过非常类似的稳定化合物推断了它的存在。O－酰基脲与氨基组分反应，产生被保护的肽和脲衍生物。或者，与质子化形式处于处于平衡状态的 O－酰基异脲,被第二个羧酸酯亲核进攻，产生对称的氨基酸酐和 N，Nˊ－二取代脲。前者与氨基酸反应得到肽衍生物和游离氨基酸。在碱催化下，使用 DCC 的副反应使酰基从异脲氧原子向氮原子转移，产生 N－酰基脲 71，它不再发生进一步的氨解。不仅过量的碱可催化 O－N 的酰基转移，而且碱性的氨基组分或碳二亚胺也可催化该副反应。另外，极性溶剂有利于这一反应途径。