Taq DNA聚合酶的特点及应用介绍
点击次数：1975 发布日期：2022-4-28 来源：本站 仅供参考，谢绝转载，否则责任自负
酶是一类极为重要的生物催化剂，具有催化高效性和反应特异性。绝大多数生化反应均需要酶的参与，核酸检测也不例外。不同类型的分子酶在核酸检测的不同实验阶段发挥了重要的作用。
一、逆转录酶，分享该酶的特点和应用
逆转录（reverse transcription）是以RNA为模板合成DNA的过程，即RNA指导下的DNA合成。此过程中，核酸合成与转录（DNA到RNA）过程与遗传信息的流动方向（RNA到DNA）相反，故称为逆转录。逆转录过程由逆转录酶催化。
大多数逆转录酶都具有以下几种活性。
①DNA聚合酶活性；
以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。逆转录酶的合成能力决定了产生的cDNA链的长短，一些基因工程改造的MMLV逆转录酶在单个结合位点中可以结合多达1,500个核苷酸，结合能力大概是野生型MMLV逆转录酶的65倍。
逆转录酶中不具有3'→5'外切酶活性，因此没有校正功能，所以由逆转录酶催化合成的DNA出错率比较高，基于MMLV的逆转录酶错误率在合成15,000到27,000个核苷酸中有一个错误核苷酸。
②RNase H活性；
由逆转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，将由RNase H从RNA 5'端水解掉RNA分子。但是RNase H活性的存在可能降低逆转录效率，所以工程化的逆转录酶，通常会降低甚至消除RNase H活性，以提高cDNA合成效率。
③DNA指导的DNA聚合酶活性；
以逆转录合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子。
除此之外，工程化的逆转录酶都具备一定的温度耐受性，有助于使具有坚固二级结构和/或高GC含量的RNA变性，使得逆转录酶能够读取序列，增加cDNA合成长度，提高合成效率。
GenFQ III Reverse Transcriptase是经过基因工程改造的新一代逆转录酶，大幅提高了热稳定性，无RNase H活性。可以在42-55℃(高温有利于打开RNA二级结构)条件下合成第一链cDNA，最佳反应温度为50℃。具有灵敏度高、特异性高、聚合能力强、 热稳定性强和半衰期长特点。该酶增强了与模板的亲和力，适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。
合成效率为95.1%，证明cDNA的合成效率较高，而且RNA梯度稀释线性关系良好。
热稳定能力强，热稳定7d对反转录效率无影响
二、Taq DNA聚合酶
PCR技术改变了现代分子生物学，而Taq DNA聚合酶改变了PCR。Taq DNA聚合酶是一种从Thermus aquaticm分离出的耐热型DNA 聚合酶，主要应用在直接PCR、等位基因检测、Sanger测序、TA克隆等领域。
Taq DNA聚合酶改具有良好的耐热型，最适催化温度在75-80℃，95℃半小时后仍保留50%以上的活性。Taq DNA聚合酶是少数具有5'-3'外切核酸酶活性的DNA聚合酶之一。能够切除5’端放射性标记的DNA探针，通过放射性信号的变化，实现PCR产物的特异性检测。
但是普通的Taq DNA聚合酶22°C时仍然有很低速的核酸合成，大约为0.25核苷/秒/酶分子，也就是说引物还没有正常配对，而酶已经催化了合成，会产生非特异性扩增。
基于Taq DNA聚合酶开发的热启动Taq DNA聚合酶，利用酶的修饰物在常温下抑制DNA聚合酶的活性，加热到变性温度时修饰物失活，酶活得以释放，从而使PCR反应正常进行，解决了PCR反应中引物二聚体产生或错配引起的非特异性扩增等问题，提高了PCR反应的特异性。
济凡生物Flash Robust HotStart DNA Polymerase （A210）是基于野生型Taq DNA聚合酶定向化改造得到的新型热启动酶，采用双抗体封闭，有效防止错配或引物二聚体引起的非特异性扩增，有效抑制探针降解产生的荧光信号下降，具有超高的扩增效率、较高的扩增灵敏度（可达个位拷贝数扩增）和特异性，具有较强的血液及PCR抑制剂耐受性。适用于各种基于Taq DNA Polymerase的热启动PCR、qPCR反应，可用于从复杂模板(基因组和cDNA)中扩增低拷贝基因，可用于血液直扩等直接扩增PCR。
以非瘟质粒为模板，进行9个10倍梯度稀释，第9个稀释梯度中质粒拷贝数浓度约为6 copies/2μl。对各稀释梯度进行检测，每孔模板使用量为2μl。可以看到，A210在宽广的模板量区间内具有优秀的线性关系，可以轻松检测出个位数拷贝的待测模板。
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