干货分享 | Real-time PCR（注意事项、常见问题）下

Question

如题所述

Answer 1

注意事项

在进行实时PCR实验时，需注意以下几点：首先，提RNA所用的枪头、器皿等耗材通常为商家处理好的成品，但在特殊情况下，实验者需用DEPC处理这些耗材。此外，市面上存在RNA酶清除试剂，能有效减少RNA降解。然而，清洗RNA沉淀所用的酒精需用DEPC处理后的水配制。其次，RT-PCR检测引物长度应控制在100bp-200bp之间，以保证扩增效率与操作简便性。为避免非特异性结合，推荐使用含基因组DNA去除成分的反转录试剂。同时，提取RNA应尽量在超净台内进行，以防止RNA污染。设置阴性对照，即使用双蒸水代替cDNA模板，有助于防止非特异性扩增。加样的准确性对实验结果影响较大，为避免误差，应混合好体系后再分装，最后添加DNA。孔板或8连管上机前离心，可去除孔壁液滴，充分混合溶液。

常见问题

在进行实时PCR实验时，会遇到样品间差异大的问题。可能原因是基因含量低，30循环以上含量较低，导致孔间差异大。解决方法是尝试减小反转录产物的稀释倍数。此外，加样不均匀，特别是加DNA模板时，可能导致枪头中的样品打不干净。建议将相同的成分预先混合均匀后再加样。另外，对于新引物，初次使用时，建议设置阴性对照，以检查引物的特异性。