紫外吸收法测定蛋白质浓度的基本原理是什么？

Question

紫外吸收法测定蛋白质浓度的基本原理是什么？
紫外吸收法测定蛋白质浓度时如何排除核酸的干扰？
3. 硅胶薄层层析法的原理是什么？
4. 硅胶薄层层析法中的点样步骤，要点是什么？
5. 硅胶薄层层析法中铺板的要求是什么？
6. 谷丙转氨酶的酶活测定原理是什么？
7. 酶活的影响因素有什么？
8. 电泳中的点样步骤，要点是什么？
9. 电泳分离蛋白质的原理？
10. 蛋白质电泳速度与什么因素有关？
11. 维生素C的含量测定实验中的关键步骤是什么？
12. 维生素C含量的高低与什么因素有关？
13. 离心的注意事项？
14. 盐析的原理？
15. 透析的原理？

Answer 1

原理：蛋白质分子中常含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等苯环结构，在紫外280nm波长处有最大吸收峰，其光吸收值与蛋白质浓度成正比，故可以用280nm波长吸收值大小来测定蛋白质含量。

优点：
1. 快速
2. 对蛋白质无破坏性

缺点：
1. 不是严格的定量方法。
因为此法是根据酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）残基的强吸收值来测定的，不同的蛋白质具有不同的消光系数。 另外，当蛋白质分子中不含Tyr、Phe或Trp残基时，该方法就不能检出蛋白。（此法用于测粗提总蛋白浓度较为适宜）
2. 核酸可引起强烈干扰

Answer 2

由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，它们具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在280nm波长处，且在此波长内吸收峰的光密度值OD280nm与其浓度成正比关系，故可作为蛋白质定量测定的依据。

本法操作简便迅速，且不消耗样品(可以回收)，多用于纯化之蛋白质的微量测定。主要缺点：1.当待测的蛋白质与标准蛋白质中的酪氨酸和色氨酸含量差异较大时，则产生—定误差（故要准确定量，必需要有待测蛋白质的纯品作为标准来比较，或且已经知道其消光系数作为参考），2. 不少杂质在280nm波长下也有—定吸收能力，可能发生干扰。其中尤以核酸(嘌呤和嘧啶碱)的影响更为严重。然而核酸的最大吸收峰是在260nm，因此溶液中同时存在核酸(嘌呤、嘧啶等吸收紫外线)时，必须同时测定OD260nm与OD280nm。混有核酸时必须分别测定280nm和260nm两处的OD值，，然后根据两种波长的吸收度的比值，通过经验公式校正，以消除核酸的影响而推算出蛋白质的真实含量，再按公式推算蛋白质含量。