hoechst 和tunel法检测细胞凋亡的区别

Question

如题所述

Answer 1

hoechst法看凋亡，主要是看sub-G1期的细胞数量。原理就是凋亡的细胞，由于DNA正在降解，所以含量比正常细胞要少。在以PI荧光强度（代表DNA量）为横坐标的柱状图上，一般会有2个峰，G1和G2，G1就是正常细胞，G2是正在分裂的2倍体。2者间是S期细胞。如果有凋亡的细胞，在G1前会有细胞出现，就是DNA含量少于正常细胞的凋亡细胞.
BIOG tunel法是运用细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上荧光素 (FITC) 标记的dUTP (fluorescein-dUTP) ，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测。

Answer 2

TUNEL法检测细胞凋亡操作步骤

操作步骤

1.用二甲苯浸洗2次，每次5min；
2.用梯度乙醇（100、95、90、80、70％）各浸洗1次，每次3min；
3.PBS漂洗2次；
4.用Proteinase K工作液处理组织15-30 min 在21–37°C或者加细胞通透液8min；
5.PBS漂洗2次；
6.制备TUNEL反应混合液，处理组用50μl TdT＋450μl 荧光素标记的dUTP液混匀；而阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液，阳性对照组先加入100μl DNase 1，反应在室温～37℃×10～30min，后面步骤同处理组。
7. 玻片干后，加50μl TUNEL反应混合液（阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×60min。
8.PBS漂洗3次；
9.可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞（激发光波长为450～500nm，检测波长为515～565nm）；
10.玻片干后加50μl converter-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min。
11.PBS漂洗3次；
12.在组织处加50～100μlDAB底物，反应15～25℃×10min；
13.PBS漂洗3次；
14.拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。
15.加一滴PBS或甘油在视野下，用光学显微镜进行计数（200～500个细胞）并拍照。

操作步骤（Promega公司）
1. 脱蜡：用二甲苯浸洗5 min×2次；
2. 水化：用梯度乙醇（100％×5 min、100％×3 min、95％×3 min、85％×3 min、70％×3 min、50％×3 min）；
3. 浸洗：0.85％NaCl×5 min→PBS洗5 min；
4. 固定：浸入4％多聚甲醛15 min；
5. 浸洗：PBS 5 min×2次；
6. 细胞通透：用每片100 ul 20 μg/ml Proteinase K处理组织15（10~30） min RT；
7. 浸洗：PBS洗5 min；
8. 固定: 浸入4％多聚甲醛5 min；
9. 浸洗：PBS 5 min×2次；
10. 平衡：加100 ul平衡液，湿盒平衡10（5～10） min；
11. 制备TUNEL反应混合液：处理组用1 μl rTdT＋1 μl 生物素标记的dUTP＋98 ul平衡液混匀；而阴性对照组不加rTdT，改为三蒸水；阳性对照组先加入100 μl DNase 1 缓冲液孵育5 min，甩掉液体后再加100 ul DNase 1（10 U/ml）酶切10 min，用去离子水冲洗4次，PBS浸洗5 min，后面步骤从第10步开始。
12. 标记反应：加100 μl TUNEL反应混合液于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37 ℃×1 h。
13. 终止反应：浸入2×SSC 15 min；
14. 浸洗：PBS 5 min×3次；
15. 封闭POD：浸入0.3％H2O2 15 min；
16. 浸洗：PBS 5 min×3次；
17. 酶标反应：加100 ul streptavidin标记HRP（按1:500 PBS稀释）30 min；
18. 浸洗：PBS 5 min×3次；
19. DAB显色（避光）：加100 ulDAB混合液（50 ulDAB+50 ulDAB底物缓冲液＋50 ul H2O220×＋950 ul三蒸水）10 min左右，镜下出现浅棕色背景时。
20. 用去离子水冲洗几次；
21. 用苏木素复染，3 s左右后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水（50、70、85、95、100、100％各1 min）、二甲苯透明1 min×2次、中性树胶封片。本回答被提问者采纳

Answer 3

tunel法是比较常用的，其中石蜡包埋组织切片在操作上还是比较方便的，室温下将石蜡组织切片放入二甲苯中浸泡5分钟。更换新的二甲苯再浸泡5分钟以彻底脱掉石蜡；用100%乙醇浸泡5分钟，更换新的100%乙醇再浸泡5分钟；用梯度乙醇（90、80、70%）将切片各浸洗一次，每次3分钟，逐渐增加水分；用PBS轻轻润洗切片，并用滤纸吸干玻片上样本周围多余的液体。这时可用石蜡笔或疏水笔在样品周围描绘样品分布的轮廓，便于下游透性处理和平衡标记操作。在实验过程中，切勿让样品干燥。处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润；用PBS稀释2mg/ml的蛋白酶K溶液，使其终浓度为20µg/ml；每个样本上滴加100µl稀释后的蛋白酶K溶液，使其被全部覆盖，室温孵育20分钟；
用PBS溶液润洗样品。轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润。注意：为得到最好的结果，蛋白酶K孵育时间可能需要优化。这样下来直接使用BIODAI的tunel盒子做，会更加方便，效果也好。