当一束单色光以垂直角度照射于某一物质溶液，部分光会被溶液吸收，透射光强度从I0减至I。这个过程中，溶液的透光率T可以用以下公式表示：
T = I0 / I
根据朗伯-比尔定律，吸光度A与溶液的性质、温度和光的波长有直接关系，用公式表示为：
A = a * b * c
其中，A代表吸光度，b是溶液的厚度以厘米计（cm），c是溶液的浓度，单位是克每立方分米（g/dm³）。吸光系数a是特定的物理参数，它取决于溶液的特性。在实验中，可能需要通过空白溶液来消除其他组分（如溶剂）对光的吸收影响。
值得注意的是，吸光度A与浓度c之间存在线性关系，前提是溶液层厚度l和吸光系数a保持不变。定量分析时，首先需测量溶液在不同波长下的吸光度（吸收光谱），找到最大吸收波长。随后，以这个波长的光作为光源，测量一系列已知浓度c的溶液的吸光度，绘制出吸光度A与浓度c的关系曲线，即工作曲线。对于未知溶液，只需测量其吸光度A，通过工作曲线就可以确定其浓度，这是分光光度法测定溶液浓度的核心原理。