抗病育种策略具体分为哪几种??

如题所述

第一种策略是来源于病毒基因介导的抗性,即利用病毒本身的基因,如病毒外壳蛋白基因,复制酶基因,反义RNA、移动蛋白基因等,导入受体植物获得抗性植株。

1.外壳蛋白基因介导的抗性

1986年R.Beachy将烟草花叶病毒(TMV)的CP基因导入烟草,培育出能稳定遗传的抗TMV烟草植株以来,转CP基因的研究日趋成熟,我国学者在这方面也取得很多成就,如成卓敏等(1996)应用基因枪法获得抗大麦黄矮病毒转基因小麦,燕义唐等(1997)用浮细胞再生表达外壳蛋白的转基因获得对水稻条纹病毒的抗病性,徐惠君等(1999)用基因枪将欧洲小麦梭条花叶病毒外壳蛋白基因(W SSMV2CP)导入小麦,董槿等(2002)抗小麦黄花叶病毒转基因小麦的获得及病毒诱导的基因沉默,刘小红等(2003)利用基因枪法将玉米矮花叶病毒外壳蛋白基因导入玉米优良自交系,姚伟等(2004)运用基因枪法将甘蔗花叶病毒CP基因(ScMV 2CP)导入易感花叶病甘蔗Badila中,获得了53株抗性转化幼苗。这些工作为我国利用病毒来源的转基因研究工作奠定了基础。

2.复制酶基因介导的抗性

由病毒编码在RNA依赖性的RNA聚合酶(RdRp)基因介导的抗性,通常即指复制酶基因介导的抗性。Golemoboski等(1990)将烟草花叶病毒TMVul株系的非结构基因导入烟草,获得了对TMV免疫性抗性的工程植株,国内外陆续报道了此类由病毒非结构蛋白基因介导的植物对病毒的抗性。我国李大伟等(1995)、王振东等(1996)、孙启达等(1996)、赵文明(1996)、鲁润龙等(1996)、项瑜等(1996)、鲁瑞芳等(1996)在甜菜、马铃薯等方面都取得成功经验。

3.移动蛋白介导的抗性

移动蛋白(movement protein,MP)是一类由病毒编码,与病毒在植物体内运转有关的蛋白。病毒在细胞间的移动,主要受病毒本身编码的MP和寄主因素控制。MP一方面能够修饰胞间连丝,增大其有效孔径;另一方面能结合病毒核酸,使病毒核酸的三维结构改变成丝状的核酸蛋白质复合体,这一复合体可使病毒较容易地通过胞间连丝。根据植物病毒植物体内,封闭或干扰MP的功能,限制病毒在植物体内的扩散,以达到抗病的目的。国外在烟草脆裂病毒、烟草环斑病毒、苜蓿花叶病毒、花生褪绿线条病毒、黄瓜花叶病毒等方面的应用,均有大量报道,张振臣等(1999)在黄瓜花叶病毒(CMV)移动蛋白基因介导的抗病性研究也取得成功。

4.卫星RNA介导的抗性

某些病毒除基因组RNA外,还伴有一些小片段RNA,称为卫星RNA(satellite RNA),携带卫星RNA的病毒称为辅助病毒。卫星RNA与辅助病毒的基因组无序列同源性,其复制需要依靠辅助病毒,而它本身对辅助病毒的复制并非必需。卫星RNA对植物病毒病的影响主要有3种:一是加重症状;二是无调节作用;三是减轻症状。因此,根据第三种影响,人们认为可以把卫星RNA转入植物从而获得抗病毒的转基因植物。Baulcombe(1986)将CMV卫星RNA的cDNA成功地转入烟草,获得的转基因植株对CMV的侵染近于免疫。

5.缺损干扰型RNA介导的抗性

缺损干扰RNA(defective interfering RNAs)是指那些直接来源于病毒的核酸序列,其所含的基因比正常病毒的基因少,但是其核酸两端以及复制起点都和正常病毒相同。缺损干扰RNA自身不能复制,必须依赖病毒才能复制。由于它与病毒核酸同源,所以不同于卫星RNA。当缺损干扰RNA和正常病毒感染同一细胞时,缺损干扰RNA可以迅速增殖,利用义链RNA去竞争病毒复制酶的结合位点,干扰了正常病毒的复制,限制了病毒的扩散。Huntley等(1996)用雀麦草花叶病毒不同片段的核酸重组成缺损干扰RNA导入水稻,转基因植株表现出显著的抗病毒特性。

6.反义RNA介导的抗性

用于翻译蛋白质的RNA称之为正义RNA,互补于一般转录所得的mRNA的RNA分子称为反义RNA。反义RNA与正义RNA形成双链分子,从而阻碍翻译的进行,导致基因产物合成减少。从理论上说,把互补于病毒CPmRNA的反义RNA转入植物,有可能阻碍病毒复制和减轻病毒对植物组织的为害,从而获得抗病毒的转基因植物。由于大多数的RNA病毒复制周期不存在细胞核阶段,且正义RNA具有高拷贝数以及在复制的全过程中与蛋白质存在相互作用,简单地使用反义RNA抗病毒策略是不大可能成功的。因此,采用反义RNA来获得具有抗病毒能力的转基因植物还需要作出更大的努力。

7.核酶基因介导的抗性

核酶(ribozyme)是一类具有特殊二级结构,能特异性催化切割自身以及其他RNA分子的小分子RNA,它广泛存在于一些类病毒和病毒卫星RNA序列中。人们可以用来切割已知序列的病原性RNA。在植物抗病毒方面,已成功地在体外合成了能切割马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)等的基因组RNA的核酶,能特异切割苹果锈果类病毒的核酶等,但在转基因植物水平上进展还较慢,体内表达不如体外表达有效。

第二种策略是利用非病毒来源的基因,如植物中自然存在的抗性基因,植物、微生物的核糖体失活蛋白(RIPs)等基因,获得抗病毒植物。主要有以下几种:

1.病程相关蛋白基因介导的抗性

致病相关蛋白(pathogenesis related protein,PR)是由植物寄主基因编码,在病程相关情况下诱导生成的一类蛋白质。植物受病毒感染时产生的过敏性反应所诱发的防御反应,主要是以植物编码的致病相关蛋白为物质基础的。它至少包括以下三个方面:①直接对病原体进行攻击(如诱导产生的水解酶类);②宿主的代谢调整以适应过激条件(如过氧化物歧化酶);③将病原体局限于侵染的位点(如木质化酶等酶类)。虽然目前转PR基因植物的抗性水平并不理想,但随着植物防御机制的深入研究,这种抗病毒手段应该具有很好的应用前景。

2.潜伏自杀基因(latent suicide gene)介导的抗性

重要是将植物来源的毒素蛋白(如抗病毒蛋白)基因,克隆到某种病毒的启动子下游,再将这一重组体以反义形式克隆到植物表达载体中并转化植物。使用PVX亚基因组RNA启动子和白喉毒素mRNA的转基因烟草显示,在上层叶片中,PVX的浓度降至1/20,而且接种PVX的叶片变黄并在接种后6~7d脱落。瞬时的基因表达甚至在没有病毒触发的情况下也是对原生质体有毒害作用的,可能是由于35S启动子反向的低水平转录所致。因此,目前此策略在大田应用的可能性值得进一步研究。

3.核糖体失活蛋白基因介导的抗性

核糖体失活蛋白(RIPs)是一类通过N2糖苷酶或核酸酶的作用使核糖体失活来抑制蛋白质生物合成的蛋白,它在许多植物、细菌、真菌中含量丰富。目前,植物来源的RIPs用于植物抗病毒基因工程的研究主要是美洲商陆抗病毒蛋白(pokeweed antiviral protein,PAP),还有来源于石竹属植物的Diathin和天花粉蛋白TCS(tiichothansin)等。Lodge等(1993)把PAP基因导入到烟草和马铃薯中,转基因烟草和马铃薯都表达出PAP,并表现出了对多种不同病毒侵染的抗性。有关研究结果表明,PAP主要存在于细胞间的汁液中,主要在病毒侵染的早期起抗性作用。由于以前使植物获得抗病毒特性的方法都是特异性,因而要使植物获得对多种病毒的抗性,就必须导入多种基因,而现在应用PAP基因介导的优点就在于不必导入其他多种基因就能使植物获得广谱的抗病毒特性。

4.植物抗体基因介导的抗性

根据免疫学原理,将某一植物病毒的抗体基因转入植物体内,使其充分表达,来抵御相关病毒的入侵。Tavladoraki等(1993)将抗菊芋斑驳皱缩病毒(AMCV)CP单链抗体(SC)的可变区(FV)基因转入烟草后,发现转基因植株表现出抗AMCV的功能。与未转基因的对照相比,其坏死病斑的数量下降了70%,且下降水平与抗体的分泌水平有关。

5.植物抗病基因介导的抗性

植物在受到病毒侵染时,会表现出不同类型的抗性,如免疫性、抗病性、耐病性以及对传毒媒介的抗性等等。如果能把编码这些抗性的基因分离出来遗传转化植物,将可以提高或增强植物的抗性,并且对植物体是安全的。但是问题似乎不是具防御作用蛋白单独作用的结果,而是它们协同作用的结果,加上分离可利用的基因非常困难,所以目前这方面的报道较少。

第三种策略是利用多基因获得抗病毒植物。前面所述的策略都是利用单一的抗性基因,并且大多是针对某一种病毒的某一步侵染过程来设计的,因此其抗性具有较强的专化性和局限性。多基因策略是利用多个抗性基因共同作用或相互作用,从多条途径破坏病毒基因组的功能表达,从而达到有效防治病毒的目的。在抗CMV的研究中,CMV2CP基因与卫星RNA中的任何一种单独转化植物都难以达到良好的效果。Yiey等(1992)将CMV2CP基因与卫星RNA构建到同一植物表达载体中转化植物,结果获得了高抗的工程植株。Lawson等(1990)将PVX和PVY的CP基因构建到同一质粒上构成双基因植物表达载体,遗传转化马铃薯,随后分别用Northern杂交和Western杂交分别证明这2种基因均得到了稳定的转录和稳定的翻译表达,用PVX和PVY同时接种,转基因植株表现出对这两种病毒的抗性。

综上所述植物抗病毒基因工程的机制可分为蛋白质介导的抗性和RNA介导的抗性两种。

1.蛋白质介导的抗性机制

蛋白质介导的抗性,是指由转基因序列表达蛋白质量的多少,来决定抗性水平高低的抗性。其主要特征是抗性水平与转基因的蛋白质表达的量成正相关。但是随着研究的深入,人们发现许多与此不符的情况。如在一些高度抗病的转基因植物内,转基因蛋白表达量很低,甚至根本检测不到。当将病毒转基因的起始密码除去后,转基因植物仍可以高度抗病,有的甚至免疫,这是不同于蛋白质介导的另一种抗性。

2.RNA介导的抗性机制

1993年Lindbo等发现RNA沉默与植物病毒有着密切的联系,提出了RNA介导抗病性的概念。他们发现,病毒侵染转基因植物后能够诱导与入侵病毒同源的转基因的沉默,并且沉默反应总是与植物对病毒的恢复反应相伴。Dougherty et al(1994)和Kalantidis et al(2002)发现,导入病毒非翻译基因的转基因植株也能提供高度的病毒抗性,转基因病毒RNA量积累很低的转基因植株,能表现出很高的病毒抗性,病毒RNA量积累很高的转基因植株却表现出很低的病毒抗性。研究表明,造成上述现象的原因是在高抗(或近似免疫)的转基因植株中,转基因RNA在病毒入侵前,由于病毒转基因本身诱发了RNA沉默机制,序列特定性的行为被降解了;而在部分抗性的转基因植株中,转基因RNA在病毒入侵前不完全启动了RNA沉默机制。转基因沉默根据其作用的部位、发生的细胞器和作用机制的差别,可分为转录基因沉默(transcriptional gene silencing,TGS)和转录后基因沉默(post transcriptional gene silencing,PTGS),二者都与基因同源性有关,因此统称为依赖基因同源性的沉默(homology dependent gene silencing,HDGS)或重复序列诱导性基因沉默(repeat induce gene silencing,RIGS)。

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