PCR 的时候，两段引物脱离后那5’端不就缺了一块了么？怎么办？那overlapPCR到底怎么通过设计引物实现

Question

PCR 的时候，两段引物脱离后那5’端不就缺了一块了么？怎么办？看到有这么一句话：

“第一次扩增时假设可以从引物向另一端无限延伸，那第二个循环时以一端是上游引物片段的序列为模板，从另一端的下游引物延伸过来，延伸到和上游引物第一个碱基处就终止了，另一个模板一样。多次循环后，体系中多数都是位于两条引物间的序列了。-----中国西部生命科学论坛”“

如果如此的话，那在重叠pcr中（overlap pc）中，，，如果体系中都是位于两条引物之间的序列，那为什吗可以通过设计引物重叠区至实现基因链接？

Answer 1

　　因为Overlap PCR中间那个引物是互补的，所以第一轮的两段PCR片段可以通过那段互补序列粘在一起。把第一轮的两段PCR产物混在一起，变性退火后有三种组合：原来的两段PCR片段，混搭在一起的PCR片段，只有后面一条可以作为第二轮的模板。追问

谢谢你的回答：但是普通PCR中的两段引物脱离后那5’端不就缺了一块了么？那在overlap时候 假如真的像这么说“体系中多数都是位于两条引物间的序列了。-----中国西部生命科学论坛”
那引物部分的设计就没意义了？？因为如果引物部分都缺了就无法扩增出互补部分5‘端的另一基因的3'端了？

追答

PCR产物中不会缺引物部分。

Answer 2

应该是你认为当他延伸完成过后引物会与合成的片段脱离，但事实上他们延伸过后在变性的过程是和延伸的dna连接在一起的追问

那岂不是每条DNA都有一段引物在。然后最后每个单链DNA都有可能成为模板的啊。那就相当于引物需求量非常大？

追答

这就是为什么带荧光标记的引物可以用于产物鉴定的原因啊，所以引物本来就是消耗品，在体系中会越来越少