我现在需要将片段1(1900bp)和片段2(1800bp)连接起来。片段1的上下游引物分别为1a,1b.片段2的上下游引物分别为2a,2b. 1b 和2a是反向互补的，约22个碱基，现在我已分别通过1a-1b,2a-2b扩增出片段1和2（酶用的是高保真酶primerstart），并进行了胶回收，然后通过1a(Tm值：47)和2b（Tm值：49）进行overlap PCR,退火温度是40°5个循环，45°25个循环，延长时间均为4min,结果没有出现目的片段，都做了好几次了，只有引物二聚体。~~~有一次做出来是弥散一片，是我模板加多了？请各位高手指教啊~~财富没有了~~请各位高手谅解！！谢谢！！
你好，非常感谢你的答案！！我查看了一下，1b和2a的Tm值均是46.65°，他们是反向互补的。你的意思是在配置PCR体系时还是要把1a和2b及酶都加进去，前10个循环用46°做退火温度，后25个循环再用47°做退火温度，退火温度均为30s，延长时间为4min?不知道这样行不行？
追答嗯，这个体系我觉得挺合理的，你可以试一试。
追问好的！！感谢！！尝试后我告诉你结果！！
追答还有，一般在初始阶段就可以加入引物1a，2b，这样可以可以增加片段1，2在反应体系中的数量，使1，2之间有更大机会可以互补配对，不用先跑十几个回合再加引物。我一般这么做成功率还是很高的。再有，如果PCR后目的条带产量不高，可以凝胶回收，再跑一次PCR，这样目的产物的量就肯定足够了。
追问你好，今天跑胶，已经看到目的条带了！！呵呵，太高兴了，但是还是有几条非特异性的扩增条带，而且我用rTaq酶可以P出来，用primerstart高保真酶就P不出来了~~只有非特异性的条带，这是为什么啊？是因为酶的效率不高吗？
追答高保真只是proofreading防止错配的能力提高几十倍，酶的复制效率要比普通taq差，不出东西的时候少用高保真酶。有目的条带就行了，切胶回收，以其为模板再做一次普通PCR就不会有非特异性扩增了。
另外，给你介绍一种新的taq酶，功能很强大，http://www.neb.com/nebecomm/products/productf-530.asp。就不知道现在国内有没有卖。
你好，谢谢你的答案。那我在前面10个循环加酶吗？我看到网上有说不加酶。还有就是一共只做15个循环码？
追答加酶。只做15循环肯定不够的。
追问那我先做10个循环，然后加入1a,2b，再扩增49°25个循环，可以吗？
追答先这样试试吧
追问你好，今天跑胶，已经看到目的条带了！！呵呵，太高兴了，但是还是有几条非特异性的扩增条带，而且我用rTaq酶可以P出来，用primerstart高保真酶就P不出来了~~只有非特异性的条带，这是为什么啊？是因为酶的效率不高吗？
追答恭喜了. 有可能对温度要求不一样。
为了除掉非特异条带，你可以跑胶后切下条带，提纯后在P一次（这次只用2头的引物）