1) PS（磷脂酰丝氨酸）细胞外膜检测：PS细胞膜内侧转移外侧细胞受凋亡诱导久发能作免疫系统识别标志AnnexinV钙依赖性磷脂结合蛋白能专性结合暴露膜外侧PS再通简单显色或发光系统进行检测由于种凋亡早期细胞检测（悬浮细胞贴壁细胞都适用）与DNA染料或别晚期检测相结合标记凋亡发展阶段
美著名物试剂公司CLONTECHInvitrogen公司别发种标记Annexin
V产品简便快速10钟完检测其带荧光标记Annexin V-EGFP（Enhanced Green Fluorescent
Protein）及Annexin V-FITC灵敏度高作FACS（流式细胞选）筛选凋亡细胞基础由于融合蛋白Annexin
V-EGFPEGFP与PS 结合比例1：1进行定量检测除外提供物素偶联Annexin
V通用酶联显色反应检测另外MACS公司磁珠包Annexin V采用磁选筛选凋亡细胞
2)细胞内氧化原状态改变检测：
反应细胞凋亡研究相较新趋势研究氧化原环境引起游事件发CLONTECH公司ApoAlertTM
GlutathioneDetection
Kit通荧光染料monochlorobimane（MCB）体外检测凋亡细胞细胞质谷光苷肽减少检测凋亡早期细胞内氧化原状态变化状态谷光苷肽（glutathione：GSH）作细胞种重要氧化原缓冲剂细胞内毒氧化物通GSH原定期除氧化型GSHGSH原酶迅速原反应线粒体尤重要许呼吸作用副产物氧化损伤由除Jurcat些其类型细胞细胞膜凋亡信号启ATP依赖GSH转移系统细胞内GSH排除非跃细胞液由原环境转氧化环境能导致凋亡早期细胞线粒体膜电位降低使细胞色素C（三羧酸循环重要组）线粒体内转移细胞液启凋亡效应器caspase级联反应
由于 GSH与氧化原作用及线粒体功能密切相关项检测除研究细胞凋亡起始非用外用于脏病、风等疾病治疗研究些细胞：HeLa 3T3细胞凋亡没明显GSH水平变化能用检测
3)细胞色素C定位检测
细胞色素C作种信号物质细胞凋亡发挥着重要作用情况存于线粒体内膜外膜间腔凋亡信号刺激使其线粒体释放至细胞液结合Apaf-1
（apoptoticprotease activating
factor-1）启caspase级联反应：细胞色素C/Apaf-1复合物激caspase-9者再激caspase-3其游caspase细胞色素C氧化酶亚单位Ⅳ（cytochrome c oxidase subunit Ⅳ：COX4）定位线粒体内膜膜蛋白凋亡发保留线粒体内线粒体富集部非用标志
ApoAlertTMCell Fractionation Kit用超离凋亡非凋亡细胞快速效离高度富集线粒体部再进步通Western杂交用细胞色素C抗体COX4抗体标示细胞色素CCOX4存位置判断凋亡发
4) 线粒体膜电位变化检测：
凋亡研究早期形态观测线粒体没明显变化随着凋亡机制研究深入发现线粒体凋亡细胞凋亡重要组部发理化变化例受凋亡诱导线粒体转膜电位发变化导致膜穿透性改变MitoSensorTM阳离性染色剂改变非敏呈现同荧光染色细胞线粒体形聚集体发强烈红色荧光凋亡细胞线粒体穿膜电位改变单体形式存于细胞液发绿色荧光用荧光显微镜或流式细胞仪清楚辨两种同荧光信号CLONTECH公司ApoAlert
Mitochondrial Membrane Sensor
Kit采用种原理检测线粒体膜电位变化种能区细胞凋亡或其原导致线粒体膜电位变化
细胞凋亡晚期核酸内切酶（某些Caspase底物）核体间剪切核DNA产量度180-200 bp
DNA片段于现象检测通两种：
1) TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling）
通DNA末端转移酶带标记
dNTP
（dUTP）间接（通高辛）或直接接DNA片段3’-OH端再通酶联显色或荧光检测定量析结美Intergen公司提供种标记直接荧光标记高辛介导荧光标记或氧化物酶联显色做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理组织、细胞培养物等种本检测其直接标记步骤少操作简便间接标记信号放作用检测灵敏度高
2) LM-PCR Ladder （连接介导PCR检测）
凋亡细胞比例较及检测品量少（体组织切片）直接琼脂糖电泳能观察核DNA变化CLONTECH公司ApoAlert?LM-PCR
Ladder Assay Kit通LM-PCR（ligation-mediated
PCR）连特异性接专性扩增核体梯度片段灵敏检测凋亡产核体梯度片段外LM-PCR
检测半定量相同凋亡程度同品进行比较
述两种都针细胞凋亡晚期核DNA断裂特征细胞受其损伤（机械损伤紫外线等）产现象细胞凋亡检测受其原干扰
3) Telemerase Detection （端粒酶检测）
相说推较早用较种端粒酶由RNA蛋白组核蛋白自身RNA模板逆转录合端粒区重复序列使细胞获永化体细胞没端粒酶性每裂染色体端粒缩短能作丝裂种钟表明细胞龄、复制衰或细胞凋亡信号研究发现90%癌细胞或凋亡细胞都具端粒酶性Invitrogen公司TRAP-eze
Telemerase Detection
Kit1996率先推提供特定寡核苷酸底物别与底物及端粒重复序列配引物待测本含端粒酶性能底物接同数6碱基（GGTTAG）端粒重复序列通PCR反应产物电泳检测观察相差六碱基DNA
Ladder现象（参见图4）外Intergen公司提供用酶联免疫（ELISA）检测试剂盒.
同种检测专细胞凋亡检测结纯反应细胞凋亡发 根据凋亡细胞固形态特征已经设计许同细胞凋亡形态检测
1．光显微镜倒置显微镜
1． 未染色细胞：凋亡细胞体积变、变形细胞膜完整现发泡现象细胞凋亡晚期见凋亡体
贴壁细胞现皱缩、变圆、脱落
2． 染色细胞：用姬姆萨染色、瑞氏染色等凋亡细胞染色质浓缩、边缘化核膜裂解、染色质割
块状凋亡体等典型凋亡形态
2．荧光显微镜共聚焦激光扫描显微镜
般细胞核染色质形态改变指标评判细胞凋亡进展情况
用DNA特异性染料：HO 33342 (Hoechst 33342）HO 33258 (Hoechst 33258),DAPI三种染料与 DNA结合非嵌入式主要结合DNAA-T碱基区紫外光激发发射明亮蓝色荧光
Hoechst与DNA特异结合性染料储存液用蒸馏水配1mg/ml浓度使用用PBS稀释终浓度2~5mg/ml
DAPI半通透性用于规固定细胞染色储存液用蒸馏水配1mg/ml浓度使用终浓度般0.5 ~1mg/ml
结评判：细胞凋亡程细胞核染色质形态改变三期：Ⅰ期细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝（creased）部染色质现浓缩状态；Ⅱa期细胞核染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期细胞核裂解碎块产凋亡体
3．透射电显微镜观察
结评判：凋亡细胞体积变细胞质浓缩凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）细胞核内染色质高度盘绕现许称气穴现象（cavitations）空泡结构；Ⅱa期细胞核染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡晚期细胞核裂解碎块产凋亡体
细胞凋亡胚胎发育、造血、免疫系统熟及维护组织器官细胞恒定与平衡乃至机体衰面都起着重要作用关凋亡研究临床基础等各领域已经广泛展,凋亡细胞检测显非重要流式细胞仪(
Flow cytometry ,FCM)
流体喷射技术、激光光技术、电技术计算机技术等集于体,较其比拟优越性既定性定量,且具简单、快速敏性高特点,进行参数体细胞析APO
研究较广泛应用辟新途径
1 光散射
FCM
系统检细胞液流通仪器测量区,经激光照射,细胞向空间360°立体角所向散射光线,其前向散射光( FSC)
强度与细胞关,侧向散射光(SSC)
强度与质膜细胞内部折射率关细胞凋亡,细胞固缩,体积变,核碎裂形,细胞内颗粒往往增,故凋亡细胞FSC 降低SSC
增高细胞坏死由于胞体肿胀,细胞核亦碎裂解故FSC SCC 均增高细胞FSC 高SSC
低根据光散射特性检测凋亡细胞主要优点光散射特性与细胞表面免疫荧光析结合起,用区别辩认经些特殊处理发选择凋亡淋巴细胞亚型,用于细胞类值注意,根据FSC
SSC
判断凋亡细胞靠性受测细胞形态均性核细胞浆比率影响,某些淋巴细胞凋亡,用光散射特性检测凋亡靠性较肿瘤细胞凋亡其靠性较差
2 细胞DNA 含量测定
细胞凋亡,核酸内切酶激,导致DNA
断裂,凋亡特征性表现,FCM 鉴别凋亡细胞奠定基础检测细胞凋亡DNA 断裂,用、简便细胞DNA
含量析细胞用乙醇、TrtionX—100 处理细胞膜现漏洞,片段DNA 细胞内释放,使其DNA
含量低于细胞二倍体用碘化丙啶( PI) 染色析,二倍体C0/ G1 ,峰前现亚二倍体峰,即细胞凋亡峰(APO峰)
,根据APO 峰测凋亡细胞百率,该简单易行,批定量检测凋亡标本,亦同析细胞细胞周期位置另外,应用FCM 通DNA
RNA 联合检测鉴别G0 期细胞,,析细胞凋亡与G1 或G0 细胸关系DNA
降解程度取决于凋亡阶段、细胞类型凋亡诱发特性染色程DNA 逸量变化影响FCM
检测结据研究,高浓度磷酸盐———枸椽酸盐缓冲液加入漂洗液,增高降解DNA 逸量,提高鉴别凋亡细胞与细胞能力
DNA
含量测定检测细胞凋亡局限性于其特异性敏性均高特异性高APO 峰代表组细胞群体,包括凋亡细胞、机械损伤细胞、低DNA
含量细胞或同染色体结构细胞,述情况,DNA
与荧光染料结合量均另外,非固定细胞低渗溶液溶解,导致量核碎片现,APO
峰细胞数目代表核碎片数目,并代表凋亡细胞数目敏性较差原细胞凋亡早期DNA 断裂点现,尚未现DNA
片段量丢失,所该能检早期凋亡细胞发于S 期或G2/ M 期凋亡细胞,其实际含量低于二倍体细胞所含DNA
,该进行凋亡细胞析应结合其形态或化,期更准确析细胞凋亡状态
3 Y 啶橙染色( Acridine Orange ,AO)
AO
细胞或细胞核双链DNA 变性DNA 染同颜色荧光AO 插入双链DNA
,发绿色荧光;AO与单链或通变性产DNA 单链发作用,发红色荧光,,通FCM
检测同荧光,判断凋亡发测定标准化,绿色红色荧光强度量与总DNA 含量比例,红色荧光与总体细胞(红色加绿色)
荧光比率表示细胞变性DNA 比例,,种用于评价DNA 原位变性敏性候,凋亡细胞DNA 降解明显,依赖于DNA
降解检测细胞凋亡细胞DNA含量测定、DNA 末端标记等难检测细胞凋亡变化AO检测凋亡原理依赖于DNA
片断产,其主要优点应用于寡核体片段与凋亡相平衡等情况,AO 染色能效区丝裂细胞凋亡细胞
4 若丹明( Rh123) 染色
细胞状态,胞膜钠-
钾泵、钙泵等作用,使细胞膜内外维持着同离浓度梯度,包括Na + , K+ ,Cl - ,Ca2 + 等,形细胞膜电位FCM
检测亲脂性离荧光染料胞膜内外布,测量膜电位高低,评价细胞力Rh123
种亲脂性阳离荧光染料,细胞膜具通透性,线粒体膜尤敏细胞存状态,若丹明123
通细胞膜,积聚于线粒体发绿色荧光细胞凋亡,线粒体膜转运能力降,电负性降低,故细胞线粒体积聚Rh123
能力丧失,荧光强度降低,据检测细胞凋亡变化应指,凋亡早期阶段,由于胞膜尚完整,数细胞器细胞功能相较,,Rh123
于早期凋亡细胞细胞鉴别比较困难
5 原位末端标记技术
细胞凋亡,DNA 断裂早于形态改变及DNA
含量减少,原位末端标记( ISEL) 渗入凋亡细胞外源性核苷酸酶DNA
催化与凋亡细胞内源性核酸酶激产单股或双股断裂相结合,较前述面具更高灵敏性通两种: ①DNA 聚合酶I 或klenow
片段介导单位缺口平移( INST) ; ②末端脱氧核苷酸转移酶介导dUTP 缺口末端标记( TUNEL)
INST
利用DNA 聚酶核苷酸整合凋亡细胞内断裂DNA 处3’末端,同水解5’末端,修复DNA
,若使用已标记核苷酸即显示断裂DNA 细胞1993 ,Gorczyca 等提末端脱氧核糖核酸转移酶( TdT)
标记采检测凋亡细胞DNA 断裂,种已广泛应用由于内源性核酸内切酶激,细胞自身染色质或DNA 切割,并产与DNA
断点数目相同3’2 羟基末端, TdT 物素化dUTP 标记至3’2 羟基末端,通卵白素2FITC 系统,使DNA
断点部位发特异荧光签别凋亡细胞,TdT 末端标记鉴别凋亡细胞比较特异种脑组织凋亡细胞少,基组DNA
片断需要更灵敏检测技术TUNEL 与FCM 结合起提高检测凋亡细胞DNA
片断灵敏度经凋亡诱导处理定间细胞,原位末端标记凋亡比Hoechst33342 染色显示要,提示TUNEL
检测尚未现明显凋亡形态特征已发DNA 裂解核,使检测灵敏度提高比研究表明, TUNEL 敏性远远高于ISNT
,尤其APO早期TUNEL 阳性率较高,能APO 发DNA 数双链同断裂,单链少见原者依赖DNA
聚酶介导修复反应,故ISNT 阳性率相较低TUNEL 结合细胞同期析,同解凋亡细胞DNA
断裂细胞周期布间关系,近已鉴别定量凋亡细胞用由于断裂DNA
标记程比较复杂,涉及种素,所末端标记阴性结并定代表DNA链完整,应排除问题,TdT
酶力丧失等诸影响素应用TdT 末端标记鉴别凋亡细胞必须同设阳性及阴性照组,便靠结
6 Annexin V/ PI
1992 Fadok 报道APO 早期位于细胞膜内侧磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserin
,PS) 迁移至细胞外侧,现象现核染色质变性与核体积缩前AnnexinV
种具强抗凝血特性血管蛋白,磷脂高亲合力,尤其与带负电荷磷脂PS 具极强结合力,利用其特性检测细胞凋亡坏死细胞PS
亦暴露于外表使Annexin V 结合阳性,使用Annexin V 参数能区坏死或凋亡,必须同采用PI
参数坏死细胆区FCM 通Annexin V —FITC 标志暴露于细胞膜PS 结合PI 进入损伤细胞膜标记降解DNA
析凋亡与坏死细胞检测4亚群包括机械性损伤细胞(Annexin - / P1 + ) 、细胞(An2nexin - / PI - )
、凋亡细胞(Annexin + / PI - ) 继发性坏死细胞(Annexin + / PI + ) 区Boersma
等应用Ampexin V2FITE染色检测细胞毒药物处理仓鼠细胞凋亡变化,FCM
检测发现荧光信号强弱同两种细胞亚群进步形态等证实弱荧光细胞亚群代表早期凋亡细胞,强荧光亚群代表晚期凋亡细胞,见其检测定量凋亡细胞种较靠细胞凋亡膜PS
外露早于DNA 断裂发,该检测早期凋亡更灵敏,且该需要固定细胞,避免PI 固定造细胞碎片及TUNEL
固定现DNA 片段丢失,更加省,结亦更靠,目前理想凋亡定量检测
7 其
7.1 ssDNA
单抗 抗单链DNA(ssDNA) 单克隆抗体用于细胞凋亡检测,种偶发现,应用ssDNA 单抗(荧光)
检测细胞毒性药物诱导DNA 损伤,观察凋亡白血病细胞(MOL T24) 较强荧光,经适改进,证明ssDNA
单抗特异识别凋亡细胞与TUNEL相比,ssDNA 具更强灵敏性TUNEL
检测凋亡细胞能单抗检测凋亡细胞亚类ssDNA检测APO 般用免疫荧光FCM
结合应用单抗使用简便、本低、应用广泛ssDNA
单抗区别坏死凋亡、甚至能检测前期凋亡,凋亡坏亡些特殊凋亡形式(片段化细胞凋亡) , ssDNA
单抗望种新特异灵敏检测细胞凋亡
7.2
细胞凋亡相关蛋白析 研究发现,少基参加凋亡调控,些基产物参与促进或抑制APO
发、发展,检测凋亡调节基蛋白研究APO 及其调控重要作用迄今止,已量细胞凋亡调节基蛋白产物析,P53
蛋白、caspases、C2myc、Fas 抗原、TNF、bcl22 家族蛋白、cyclin、ras 等FCM
用荧光标记各种调控蛋白单抗染色,收集同波荧光信号,检测细胞膜表面或细胞内荧光数量,解每细胞变化,且所需品少,简便、快捷、准确
8 展 望
近几,随着FCM
技术断发展APO 研究逐渐深入,FCM 细胞凋亡研究益广泛应用FCM
定量检测凋亡细胞简便、快速、客观,并进行参数检测,,同APO
及其相关癌基表达、细胞周期布等诸素进行相关析,比较深入解凋亡调节机制尽管应用FCM
进行细胞凋亡研究较,FCM检测凋亡细胞般基于细胞凋亡程形态、化等某面特性,难于解凋亡程发各种变化相互关系,使该类缺乏特异性,所,联合应用种针同特性FCM
检测,才能更效鉴别凋亡细胞同,FCM
研究结尚需同结合形态观察或物化,才能更加深入解凋亡细胞物特性随着物技术发展及APO
本质认识深入,相信久,定更特异敏问世,助于细胞凋亡取突破性进展
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